摘要：阿替林酯/赖氨酸盐（AL）能克服青蒿琥酯（AS）在水溶液中的不稳定性。为了选择最有效的青蒿素治疗方法，在一个简单的非人灵长类动物疟疾模型中进行了直接比较。

 

方法：脾切除猕猴接种柯氏疟原虫，第6天后，每天静脉注射AL（11.8毫克/公斤）或AS（8毫克/公斤），首次剂量的一半，连续2天以上。每日进行两次血涂片，显微镜下计数寄生虫数。在第一次剂量后6小时内采集血样进行药代动力学（PK）和体外药效学评价。同时测定血浆药物浓度及抗疟活性。

 

结果：两种化合物的体内抗疟活性可相媲美，但体外抗疟原虫效力的AS 静脉注射给药方案比AL 静脉注射给药高7倍。比较AL和AS的体内药效学，每日评估寄生虫计数显示相当于99%寄生虫清除时间、寄生虫清除率和清除半衰期。pct1 / 2和Cmax之间适度呈负相关。尽管所有测试猴随后复发，在寄生虫清除前，有两只猴死于AL方案。虽然这些死亡的病因不能明确确定，病理证据支持脓毒症样综合征。表明动物更可能发生严重疟疾，而非药物中毒。

 

结论：该模型表明，As和DHA有助于AS  静脉注射的抗疟活性，而AL  静脉注射活性主要限于母体药物。两种青蒿素治疗方案的寄生虫清除率与药物暴露呈强线性关系。然而，AS  静脉注射对恶性疟原虫具有更高的体外效力。

 

 

背景：尽管发病率和死亡率有所下降，每年全球仍有一百万人死于严重疟疾，其中包括旅行者。严重的疟疾是由于疟原虫感染并发严重的器官衰竭或代谢异常而迅速发展并在24～48小时内死亡，需要胃肠外治疗。自1991以来，奎尼丁在美国仍然是唯一获得FDA批准的药物用于重症疟疾感染。连续输注时需要对心脏和血糖进行监测。开发和测试青蒿琥酯（as）作为奎宁替代物。静脉注射AS有低血糖风险。与静脉注射奎宁相比，已显示出显著降低重度疟疾死亡的风险。青蒿琥酯在资源贫乏的环境中也是一个更为实用的选择，因为给药更简单（注射注射），不需要缓慢控制输注速度和心脏监测。

肠外青蒿琥酯的试验中，曾考虑开发新的青蒿素衍生物，阿替林酯/赖氨酸盐（AL）作为临床治疗重症疟疾的抗疟药。阿替林酯（青蒿素半合成衍生物），不容易转换成双氢青蒿素（DHA）目的是要克服青蒿琥酯钠在水溶液中的不稳定性，必须注射前在床侧准备。临床前疗效和毒性研究被用来选择其中一种青蒿素候选药物作为重症疟疾治疗药。比较大鼠疟疾模型静脉注射AL和AS的抗疟清除率显示AL比AS在寄生虫清除率方面有更高的抗疟效价比。然而，大鼠模型也显示AL比AS毒性高。几种非人灵长类动物疟疾模型可作为有用的人类试验前评价新药的模型。柯氏疟原虫能引起脾切除亚洲灵长类猴疟疾，未治疗猴有较高的死亡率。该模型最能模拟恶性疟原虫引起的严重和复杂疟疾。已经用这个模型来研究由于脂溶性段脑损伤药物毒性的风险。本研究比较静脉注射阿替林酯与青蒿琥酯的药代动力学与药效学检测治疗重症疟疾的新候选药物。

 

方法：柯氏疟原虫恒河猴模型：柯氏疟原虫感染的红细胞被冻存。检测其稳定性，并确认B病毒，SRV，SIV和STV-1阴性，确保没有任何不确定的病毒被引入猴群体。22只印度恒河猴进行脾切除手术，在进入研究前1个月恢复良好。所有的猴都无B病毒，SIV，SRV和STLV抗体。动物健康检查包括完整的体格检查、全血细胞计数、ALT和肌酐。22只动物随机分为两个实验，每组11只猴子。每个实验包括十只实验猴（IV和AS）和一只对照动物。对照组接受肌肉内注射奎宁治疗，实验动物静脉注射青蒿素候选药物。

 

供体猴感染：每个实验组，解冻后一个稳定培养柯氏疟原虫感染的红细胞，试验猴静脉内接种1毫升的等分试样。该操作过程中猴子被氯胺酮麻醉（5-15毫克/公斤，IM）。每日监测寄生虫水平，在寄生虫密度达到每微升> 50000寄生虫, 从股静脉取5-20毫升的血液注入肝素抗凝管。血被等分为1毫升（约5×106红细胞中含1%寄生虫）为研究动物接种。然后，供体动物用盐酸氯喹10毫克/公斤/天IM注射治疗5-7天。这是柯氏疟原虫感染动物的标准治疗方案。注射是可行的，因为它可以用"挤压笼"机制进行最小的动物处理。每天监测动物，以5～7天的治疗范围血涂片作为评价阴性的基准。

 

寄生虫和临床监测：每天至少观察两次动物，以评估严重疟疾的临床症状和相关因素。在我们以前的模型验证的基础上，在第0天接种前开始进行血液涂片检测疟原虫。猴在挤压笼约束装置中身体被约束，每只猴子通过侧耳静脉穿刺刺取约0.1 - 0.2毫升全血。在同一载玻片制作厚、薄涂片，随后甲醇固定，并用姬姆萨染色。当涂片阳性，也用自动血液分析仪Sysmex K800进行白细胞计数（WBC）和/或红细胞计数（RBC）计算寄生虫密度。在研究的第6-12天，在下午从所有的动物获得了额外的血液样本监测寄生虫水平。每日血涂片一直持续到连续两天涂片阴性为止。然后，血涂片监测计划每周减少两次，为期2周。然后在最后一次治疗结束后的6周内每周进行一次。60毫克/公斤奎宁IM治疗及30毫克/公斤每8h一次连续3天治疗失败或复发。治疗在每微升寄生虫大于200000个时开始。血涂片染色和寄生虫检测花了大约2小时。结果确定后，首次治疗。对照组接受奎宁治疗，十只实验组动物静脉注射青蒿素衍生物。动物受过训练。坐在猴椅上接受静脉注射和抽血，不使用化学抑制以避免伴随麻醉的潜在混杂和抑郁。

 

化学物：阿替林酯/赖氨酸盐（AL）粉用1 g的酸含量相当于1.35克的盐量。静脉注射AL含40毫克/升AL，通过将计算的AL盐重量溶于0.45%的NaCl溶液/0.1%赖氨酸（W/V），通过0.2微米醋酸纤维素过滤膜灭菌。额外的AL浓度溶液通过含0.1%赖氨酸盐的正常0.9%NaCl溶液，通过0.2微米醋酸纤维素过滤膜灭菌。静脉注射青蒿琥酯/钠盐（AS）是在每次注射前将其溶解在5%碳酸氢钠中。

 

给药方案：单等摩尔剂量20μmol AL（11.8mg/kg  IV）和AS（8 mg/kg  IV）在1分钟内快速静脉注射。这些剂量被选定为最小有效剂量，并收集血液进行药代动力学分析。柯氏疟原虫从供体猴中取出接种到所有实验猴。治疗在接种后第6天开始，此时体内寄生虫达到大于每微升大于200000。第二天和第三天给药剂量为首次给药剂量的一半，共给药3天。个体差异可能是由于疟疾感染的疾病影响所致。

 

采集血样及样品制备：由于青蒿素衍生物的快速清除，第一次给药后收集血液进行药代动力学/药效学分析（PK／PD）分析。在给药后1、5、20、40分钟和1、3、6h采集血液放入抗凝管中，并在2h内通过离心（1500g，10min）分离血样。等分的样品进行高效液相色谱法测定，并存储在?80°C直到分析。

 

体外恶性疟原虫生物测定（BA）：用先前发表的方法测定了青蒿素衍生物的血浆抗疟活性。血浆与蛋白A孵育，以去除大部分免疫球蛋白（IgG）导致红细胞内寄生虫的裂解。离心后，上清液（100?L）转移到96孔平底板。使用热灭活血清（人：恒河= 1:1）进行双重稀释。每孔都添加疟原虫感染的红细胞。微量滴定板被放置到一个密封的有机玻璃室，含有90%的二氧化碳，5%氧的和5%氮气的混合气，并放置在孵化器中（37°C）。培养24 h后，取出每孔中添加[3H] -次黄嘌呤后继续孵育18-20h。使用计数器记录吸收次黄嘌呤的寄生虫。测定各血浆样品抑制50%寄生虫生长（DF50）的稀释因子值。使用DF50值，血浆样品的抗疟活性用线性标准曲线推算。最有效的青蒿素衍生物，以DHA当量表示。

 

寄生虫计数的评估：每天早晨采集一次血进行涂片。一旦观察到每微升2000寄生虫阳性体，在上午和下午收集两次血进行涂片。从耳中采集血液制备厚涂片和薄层涂片。载玻片上的血膜风干后，用100%甲醇固定，姬姆萨染色，100倍油镜下观察。一张涂片至少选取50个观察点，如果在所有50个观察点没有发现寄生虫，判定为阴性。如果每个观察点发现平均有5个寄生虫，寄生RBCs的寄生虫数为100的白细胞。每μL血含寄生虫用公式表示：【寄生虫数/100(WBCs)】x每微升血液WBC数量。通过自动血液分析仪Sysmex K800隔日测定全血细胞。如果每个观察点发现平均多于10个寄生虫，寄生RBCs的寄生虫数为1000的白细胞。当密度大于五寄生虫时，使用薄层涂片。如果寄生虫密度小于10（寄生虫数量计算方法同厚涂片相同）。通过计算感染红细胞的数量与未感染红细胞的数量来确定感染红细胞的百分比。

 

体内药效学（IPD）分析：建立寄生虫密度时间曲线，利用寄生虫清除量估计器估计寄生虫清除参数。参数是寄生虫清除率（PCR），清除半衰期（PCT）、PC50、pc95，PC99。此外，通过显微镜评估寄生虫清除时间（PCT）（定义为开始治疗的时间到连续两个阴性血涂片）。

 

结果：临床结果和体内药效学（IPD）：两个治疗组的猴有相当的年龄和体重。接受奎宁治疗组及AL、AS组猴寄生虫密度分别为每微升血液773550和510260.虽然静脉注射AL组有较高的寄生虫起始密度和较长的pc95。但PC99，PCR和pct1 / 2没有显著差异。这两种制剂清除寄生虫速率太快，没有足够的数据点来确定所有动物PC50。AL注射后，2.5h内感染动物死亡2例。有疟疾和肝小叶变性。虽然没有明确的死亡原因，但研究结果更倾向于诊断为严重的疟疾而不是药物毒性，特别是因为这些剂量在实验中被其他动物耐受得很好。因为寄生虫计数从未达到零，PCT只能在4天和5.3天内测定治疗组6只动物失败。与此相反，AS组所有猴子PCT都确定为平均7天，IQR在5.1天和8天之间。然而，两只猴最快PCT发生在4天和5天。剩余的八只猴子PCT为8天，IQR出现在5.8天和8.3天之间。PCT与初始寄生虫密度无相关性。此外，AL治疗后第4天，寄生虫平均持续增加，而AS治疗后的寄生虫在1周后持续减少和清除。但是所有猴均复发寄生虫病，AS组平均13天时，AL组平均6.5天。

 

结论：在非人灵长类动物模型中，给药后前20min，AS组有更大对抗恶性疟原虫体的效力。该模型表明，寄生虫清除依赖药物暴露包括两种青蒿素疗法的AUC和Cmax。