摘要：早期发现早产儿视网膜病变（ROP）是治疗和预防儿童失明的目标之一。研究的目的是评价玻璃体腔内注射2-甲氧雌二醇（2-ME）对消退早产视网膜病变大鼠模型新生血管的功效。

 

方法：对28只健康的雄性SD大鼠D的56只眼睛进行了研究。21只大鼠诱导ROP。两种浓度2-甲氧雌二醇（2-ME）注射到14只大鼠的右眼（低剂量；研究组I，高剂量；研究组II）。空白纳米乳注射到7只大鼠右眼（阳性对照组I）。对侧左眼不注射（对阳性照组II）。7只（14只眼）在室温条件下饲养（阴性对照组）。在出生后17天，摘取眼球。HE染色观察视网膜的组织结构。免疫组化法检测血管内皮生长因子（VEGF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。

 

结果：玻璃体腔注射2-ME造成新的血管丛显著消退，尤其是研究II组视网膜厚度也表明VEGF阴性反应。对照阳性组和研究组（i）观察到GFAP阳性表达。

 

结论：玻璃体腔注射2-甲氧雌二醇（2-ME）对减少ROP大鼠模型新生血管是有效的。

 

 

背景：早产儿视网膜病变（ROP）是一种影响早产儿视网膜的疾病。由于局部缺血而发生视网膜新生血管（NV）。在更严重的疾病类型中，异常血管改变进展为视网膜剥离。一旦发生视网膜剥离，预后视力恢复的较差。研究视网膜异常血管生成最流行的模型是氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型。将一周龄的幼鼠暴露在高氧状态下。高氧破坏视网膜毛细血管。回到房间正常氧环境中，视网膜变得缺氧并引发修复反应，从而导致新生血管簇向玻璃体形成。这是缺血性视网膜病变的一个重要标志。簇的形成被称为"病理性血管生成"并使OIR动物模型成为缺血性视网膜病变血管病理研究的重要工具。OIR模型模拟ROP的发生，包括早产儿的病理改变。在出生后第18天，视网膜血管和神经功能发生了显著变化。由于产生过量的血管内皮生长因子（VEGF），大鼠动物模型视网膜血管的通透性比正常大鼠高。此外，星形胶质细胞变性还包括血-视网膜屏障的破坏。2-甲氧雌二醇（2-ME）是17 B -雌二醇的生物活性代谢产物，抑制与体外细胞复制相关的关键流程。它可能对增殖细胞有很强的生长抑制作用。包括平滑肌细胞和内皮细胞，并在体内可能抗血管生成。本研究旨在探讨玻璃体腔注射不同浓度的2-ME对新生 OIR大鼠模型的疗效。

 

方法：研究设计：选用28只健康大鼠，每笼饲养2只，并在试验开始前适应环境一周。大鼠自由采食和饮水。21只大鼠诱导ROP，其中2种浓度的2-ME被注射到14只大鼠的右眼（低剂量，研究组I；高剂量，研究组II），空白纳米乳注射到7只大鼠的右眼（阳性对照组I），对侧左眼不注射（阳性对照组ii）。其余七只大鼠（14只眼）饲养在室内空气中，不接触高浓度氧或药物（阴性对照组）。

 

实验方案：早产儿视网膜病变的诱导：本研究使用Smith等人开发的ROP模型。新生SD大鼠在出生后第7天到第12天暴露在75%的高氧中，母鼠饲养在特殊培养箱中。在出生后第12天，动物被送回正常室内空气（21%氧）。

 

空白纳米乳的制备：500μL Labrafac的亲脂性油加入到PH 7.4含0.1%吐温80的50 mL磷酸盐缓冲液中。

 

2-甲氧雌二醇纳米乳的制备：采用高剪切均匀化方法制备2-ME纳米乳。药物溶解在500μL Labrafac的添加1ml乙醇的亲脂性油中，后加入到PH 7.4含0.1%吐温80的50 mL磷酸盐缓冲液中。在24000 rpm进行纳米乳匀质化。经过2小时的磁力搅拌，保证了乙醇的完全蒸发。2-ME纳米乳制剂，低、高剂量纳米乳都显示为161 nm，多分散指数0.23粒径单分散均匀。

 

玻璃体腔注射2-甲氧雌二醇疗法：在完全无菌条件下，于出生后第12天进行玻璃体腔注射。腹腔注射盐酸氯胺酮（40 mg/kg）和盐酸甲苯噻嗪（5毫克/毫升）深入麻醉新生大鼠。用一滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液对眼睛进行局部麻醉。在立体手术显微镜下，右眼巩膜上鼻部分在角膜缘后1.5毫米处穿孔。用30号胰岛素针安装在注射器上，其含有0.02毫升的类固醇， 1%托吡卡胺滴眼液扩张瞳孔。避免针尖对视网膜的损伤。类固醇或空白纳米乳注射液进行玻璃体腔内注射超过3分钟，避免回流。OIR模型大鼠右眼模型（21只）随机分为以下几组：

阳性对照组I：7只大鼠右眼注射空白纳米乳。

研究组I（低剂量雌二醇治疗组）：7只大鼠右眼接受了0.02ml的低剂量2-ME纳米乳（10ug/ml）。

研究组II（高剂量雌二醇治疗组）：7只大鼠右眼接受了0.02ml的高剂量2-ME纳米乳（100 ug/ml）。

 

组织化学：在出生后第17天，处死动物。摘取眼球后，解剖眼球和冠状切分成前、后段。包含视网膜的前部和后部被进一步分为两部分，并获得各部视网膜周边部。标本立即用10%中性福尔马林固定，然后进行石蜡切片处理。标本被切成5～7微米厚。HE染色观察并检查眼前段药物毒性。

 

免疫组织化学：根据Youssef等人的方法检测血管完整性和血管内皮功能，免疫组织化学染色的方法检测血管内皮生长因子（VEGF）。根据陈等人的方法检测胶质细胞反应性，进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化染色。

 

结果：对所有大鼠进行临床检查，研究组（i）一只眼（14.3%）玻璃体腔注射后48小时出现眼内炎。这只眼睛没有接受组织病理学检查。研究组（I）的一只眼睛（14.3%）和研究组2只眼（28.6%）出现白内障。在任何研究组睫状体或角膜没有出现任何组织学异常。对照组大鼠视网膜组织学图像显示视网膜十层正常排列。阳性对照组（i）和（ii）组织学变化相似。感光器层伴随纤维平行层减少呈现不规则外形。在一些切片中，表现出许多空泡和灶性丢失。在外核层细胞密度下降导致细胞之间出现间距。外丛状层（OPL）失去正常的外观和表现出明显的变形。内核层（INL）显示细胞密度和细胞之间的间距减少。一些血管出现在这一层。内丛状层（IPL）显示一种海绵状外观的纤维之间的空间扩大。神经节细胞层（GCL）被发现显著解体，与对照组相比，细胞密度下降。在这一层观察到血管。神经纤维层厚度（NFL）减少。

 

增殖性视网膜病变的定量研究：阴性对照组视网膜正常模式，在出生后17天，由分支的浅血管连接深血管层，从视神经延伸至锯齿缘。HE染色，没有发现血管超出ILM进入玻璃体。从出生后7天到出生后12天高氧暴露的大鼠眼睛，出生后17天回到房间正常空气（对照阳性组II）有新生血管丛，伸出膜进入玻璃体（阳性对照组I）。

由于高氧产生的新生血管通过对ILM玻璃体侧血管内皮细胞核数计数。正常出生后17天大鼠，每6μm视网膜横截面在ILM玻璃体侧没有检测到核。虽然在高氧暴露的视网膜中，每6μm截面的深部血管并不多，但平均轮廓在横截面积上更大，HE染色比正常视网膜的血管轮廓更为严重。这意味着在纳米乳组和OIR对照阳性组（II）之间血管内皮细胞核数对ILM玻璃体侧乳组差异无统计学意义。对照阳性组和其他研究组的细胞核平均数显著高于对照组。且治疗后开始显著减少。在研究组中进行比较，发现研究组（I）和（ii）之间没有统计学上的显著差异。玻璃体腔注射2-ME有明显的血管消退。

 

免疫组化：VEGF免疫组化染色：阴性对照组视网膜各层均呈阴性VEGF免疫组化染色。阳性对照组和研究组（I）在GCL， INL和ONL几个细胞显示微弱的VEGF免疫组化染色。研究组（II）视网膜显示所有视网膜VEGF阴性反应。阳性对照组（I）、阳性对照组（ii）、研究组（I）和研究组（II）VEGF免疫组化染色面积平均百分比分别为0.015、0.02、0.03和0.07。

 

GFAP免疫组化染色：在阴性对照组，GFAP标记主要分布在GCL，NFL和ILM。其他层GFAP免疫组化染色呈阴性。阳性对照组和研究组I的GFAP表达强度明显高于阴性对照组。GFAP免疫组化染色明显增加，Muller细胞放射状突起延伸至整个视网膜厚度甚至光感受器之间。在研究组（I）中，GFAP免疫组化染色伴随着视网膜内层Muller细胞的分布；一些染色的过程被视为穿越INL细胞之间。在OPL发现轻度GFAP的表达。研究组（ii）与对照阴性组结果相似。表现出有限的GFAP的表达仅限于GCL，NFL，和ILM。

 

结论：2-甲氧雌二醇纳米乳对ROP模型大鼠新生血管减少有效。但还需要更多和更详细的研究来确定2-ME的注射剂量和注射时间来治疗人的早产儿视网膜病变。