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模型制备

急性肾盂肾炎动物模型

2017年09月05日 浏览量: 评论(0) 来源:《人类疾病动物模型复制方法学》 作者:周光兴 责任编辑:yjcadmin

1 单纯感染模型

(1)复制方法  体重为200g左右大鼠,禁止饮水24h后,事先用细线扎住大鼠阴茎。在乙醚吸入麻醉下,动物仰卧固定手术板上,常规消毒腹部皮肤并去毛,沿动物下腹部作正中剪开,充分暴露膀胱,用注射器直接向膀胱内一次性注射浓度为1000000/ml的大肠埃希菌(O111B4)菌液,每只注射量约0.5ml,手术缝合切口,关闭腹腔。1h后松开扎阴茎细线。术后恢复动物正常饮水与进食。分别于预定时间处死动物,取其两侧肾脏,小心去除肾包膜;然后纵向切开肾脏,一半匀浆后行细菌培养,另一半置于固定液中固定,作常规组织切片,HE染色,光镜下观察。同期膀胱穿刺作尿液细菌培养。

(2)模型特点  术后3d尿液能培养出细菌,于麦康凯培养基上生长出红色圆形菌落;至7d时仍有80%的动物细菌培养阳性,15d时则仅有少数动物细菌培养阳性。肾组织细菌培养大部分动物双肾细菌培养为阳性,部分动物为一侧肾脏培养阳性。至第15日时,仍有少数肾脏细菌培养阳性。大体标本肉眼观察可见模型动物双肾体积均有不同程度增大,肾表面无明显脓肿;其纵切面可见肾盂扩张,黏膜充血,肾皮质、髓质分界不清。镜下病理学观察显示,3d时肾盂黏膜下及间质区以中性粒细胞为主伴有少量淋巴细胞的炎症细胞浸润,毛细血管扩张、充血,间质水肿。第7日时肾盂黏膜下及间质内可见淋巴细胞灶性浸润,并可见少量嗜酸性粒细胞,间质毛细血管扩张;至15d时仍可见间质淋巴细胞浸润,毛细血管增生、扩张,并有少量纤维母细胞、肉芽组织形成。

(3)比较医学  大肠杆菌诱导建立逆行性肾盂肾炎动物模型是通常采用的方法,但这些急性肾盂肾炎(acute pyelonephritis, APN)模型均建立在单侧输尿管结扎的基础上,制备过程较为复杂,且两侧肾脏病变有明显差异。本模型采用单纯膀胱内注射、不结扎单侧输尿管的方法,用较小剂量细菌直接膀胱内注射并保持一定的停留时间,细菌可逆行侵犯至肾盂,肾组织内可见典型的炎症过程(由粒细胞浸润一淋巴细胞浸润为主一肉芽组织形成),但炎症急性期维持时间较短(3~4d),病变程度相对较轻,无明显的化脓灶形成,并具有一定的自我修复趋势,类似于临床上常见的轻型APN。

2 手术加感染模型

(1)复制方法  大肠埃希菌(O111B4)菌液的制备:将菌种接种于肉汤培养基,37℃、5%CO2孵箱内孵育12h,利用倾斜平板法制备1000000/ml浓度菌液待用。体重为200g左右雄性大鼠,禁止饮水18h后经腹腔按30mg/kg体重剂量注射戊巴比妥钠麻醉。动物仰卧固定手术板上,常规消毒腹部皮肤并去毛,铺无菌手术巾。沿下腹部作长约2cm正中切口,逐层切开腹壁进入腹腔,充分暴露左侧输尿管及膀胱;用4号缝合丝线从中段输尿管两旁分别向侧腹部穿针并引出缝合线,两针尽量保持相近,暂不结扎,用动脉夹夹闭阴茎,用 TB针向膀胱内缓慢注入0.75ml菌液。然后拉紧腹壁外面的缝合线两端,以适当松紧度“结扎”输尿管。逐层缝合腹壁切口,松开阴茎动脉夹,术后动物恢复常规饲养,自由饮水和进食。手术后20h,拆去腹壁外面输尿管结扎线,使输尿管重新开放。分别在规定的时间用动脉夹夹住大鼠阴茎后,用乙醚麻醉,仰卧于手术台上,无菌条件下开胸、开腹,抽出心血和尿液,切取左右肾脏和脾脏,作肉眼检查、细菌培养及病理组织学检查。

(2)模型特点  术后第3日模型动物膀胱尿液即能培养出细菌,于麦康凯培养基上生长出红色圆形菌落。第7日时细菌培养阳性率分别可高达80%以上,这种高阳性率可持续保持15d以上。结扎一侧肾脏肾组织细菌培养也有细菌生长,未结扎一侧肾脏细菌培养阳性少见,且持续时间较短。心血和脾脏细菌培养均为阴性。肉眼观察模型动物左肾体积较右肾有不同程度增大,左肾表面可见数量不等的微小脓肿,个别肾脏有突出肾表面的较大脓肿;切面肾盂扩大,黏膜充血、肿胀,肾盂内有脓性分泌物,有的肾切面可见微小脓肿或锥形炎症灶。右肾外观和切面未见明显异常。镜下病理观察显示,术后3d模型动物左肾肾盂肾盏黏膜充血肿胀,有的可见黏膜表面有局灶性脓性分泌物,黏膜下可见大量中性粒细胞浸润。肾间质血管充血,多数肾脏可见脓肿,在一些肾乳头部尚可见大小不一的锥形炎症灶;肾小管不同程度扩张,以远曲小管为重;小管周围有较多中性粒细胞浸润,部分肾小管上皮细胞坏死、脱落,管腔内可见脓细胞及少量管型。肾小球无明显损伤。术后7d动物左肾间质炎症细胞减少,肾盂黏膜下、肾小管周围可见以中性粒细胞为主,伴有较多淋巴细胞和单核细胞的炎症细胞浸润;脓肿灶边缘出现较多成纤维细胞,灶内除有中性粒白细胞外,尚有大量淋巴细胞、单核细胞。肾盂黏膜充血肿胀减轻,黏膜下中性粒细胞细胞浸润明显减少,出现较多单核细胞、淋巴细胞。右肾组织无明显组织形态学改变。

(3)比较医学  肾盂肾炎是临床上发病机制较为复杂、常见和危害较大的尿路感染疾病。APN如治疗不当常可复发或转为慢性,并引起患者出现肾功能衰竭。虽然临床上采取了包括各种抗生素在内的许多治疗措施,但肾盂肾炎的发病率、复发率和转慢率并未见明显降低,复制与人类肾盂肾炎相似的动物模型,对探讨研究本病的发病机制及治疗方法具有重要意义。本模型采用大鼠作为实验动物,是因为其大小适中,易于辨认输尿管,尤其是大鼠泌尿管解剖特点,容易发生尿液自发性反流,有利于造成逆行性感染,与人类肾盂肾炎的感染方式接近。本模型制作时需根据细菌毒力大小适当调整膀胱内注菌量,否则容易导致动物出现败血症或血源性肾盂肾炎;同时,为保证模型成功手术时应尽量避免膀胱痉挛,输尿管结扎的松紧度应适当,控制手术时的温度及湿度是十分必要的。本方法制作的动物模型,从致病菌、传染途径和病理学改变等方面均与人类APN相似,且模型制作方法简单,重复性好,是研究人类肾盂肾炎合适的动物模型。

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