摘要：纳米碳酸钙在药物和代谢产物的递送方面有着广阔的应用前景。缺乏关于他们有意或意外过度暴露于生物系统和一般健康安全方面的信息。为此，本研究旨在用SD大鼠进行来源于海扇壳（ANC）的生物纳米碳酸钙皮下给药研究其安全性。对SD大鼠进行了急性毒性重复剂量28天毒性试验，采用透射电镜和场发射扫描电镜对其毒性进行了评价。结果表明，均质30～5 nm球形纯文石纳米晶与大鼠死亡率无相关性。急性毒性（29500毫克/平方米）和重复28天剂量的高剂量组（5900毫克/平方米）记录了严重的临床症状和大体器官组织病理学损害，表明有器官毒性。然而，重复28天剂量的中等（590毫克/公斤体重）和低（59毫克/平方米）剂量组表现为中度至轻度病变。低毒剂量组观察到相对较轻的病变。研究结果表明，碳酸钙的毒性取决于颗粒大小（30±5 nm）、浓度及给药途径。

 

 

背景：纳米粒子（NPS）是在纳米颗粒的所有外部尺寸其中最长和最短的轴线长度相差不显著。呼吸道、皮肤、消化系统已被确定为纳米粒子进入人体的三个主要途径。事实上，NPS可以通过获得、积累，通过血液在脏器，体内分布和富集，构成重大危害。除了血液外，机体细胞中的核吞噬作用和细胞内吞作用，在进一步将纳米颗粒向远处器官扩散中起着非常重要的作用。无论天然障碍如何，在肝脏、脾脏、心脏和大脑中都发现了低浓度的NPS。关于NPs及其残留物在体内的命运，以及它们是否积聚在某些器官方面，尚未得到解答。作为药物载体系统的工程纳米粒子需要充分了解其健康安全性。虽然碳酸钙被认为普遍安全和作为生物制剂皮下注射成功的载体获得认可。但对故意或意外接触高剂量可能产生的毒性缺乏了解。本研究旨在用雄性和雌性SD大鼠评估急性及重复皮下注射海扇壳衍生的纳米文石型碳酸钙（ANC）的安全性。

 

动物及材料：从海扇壳制备微米文石碳酸钙粉。干净的贝壳用100度的超滤水煮10min，后冷却至室温。在用50度烘箱干燥7天前，用蒸馏水进行二次冲洗。贝壳磨成粉后，用75微米的不锈钢筛过滤，获得75微米左右的颗粒。过滤得到的颗粒进一步在烘箱中干燥10h，用研钵进行研磨，进一步减少其直径。微米级文石型碳酸钙粉（MAC）进一步在烤箱中50°C干燥7天。透射电子显微镜（TEM）是用来确定ANC形状和尺寸。将100μg粉末分散在1毫升100%丙酮中制备透射电镜样品。其次是超超声处理30分钟。然后将一滴上清液放在碳覆盖的铜网上，放置在滤纸上，室温下晾干。

 

十四天急性毒性研究：两组10周龄雌性sd大鼠，（毒性和对照组）（每组三只），两种不同皮下剂量(1770 and 11,800 mg/m2)用于初步评估ANC的急性毒性。在两次剂量试验（两次14天试验）的死亡率不变的情况下，最后一组设计与先前相似的对照组，皮下注射剂量为29500毫克/平方米，并密切监测14天的毒性和死亡率。

 

重复给药28天试验：四组，每组6只（3雌，3雄）6周龄SD大鼠。动物分为三种不同浓度组，分别为低、中、高剂量组，分别皮下注射59, 590和5900 mg/kg。给对照组等量的赋形剂。对动物进行了密切监测，观察其28天毒性和死亡率。

 

组织处理：骨头是10%中性福尔马林固定后的3天，每24 h更换一次福尔马林。骨转移到80%甲酸脱钙1周。脱钙骨和2厘米的内脏标本用10%中性福尔马林固定3天用于组织切片。石蜡包埋组织切片，厚度5μm。HE染色，镜检。

 

结果： ANC表征：分别在TEM、FESEM下看ANC的大小、形状。晶体呈球形，直径为30±5 nm。

 

临床观察：实验的初始剂量没有毒性迹象（1770和11800毫克/平方米），在实验结束时没有死亡率。而最终用于研究的剂量（29500毫克/平方米）出现毒副反应。毒性试验组在实验第3天出现注射部位水肿。在实验的第六天大鼠出现厌食昏睡和呼吸困难、发热、心动过速和毛发脱落。这些迹象在实验剩下的几天里变得很严重。注射部位水肿消退，坏死。实验结束时，大鼠出现严重的坏疽损伤。

 

血液学和血清生化：毒性组的某些血液学参数与对照组无显著差异。毒性组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）总胆红素、肌酐、尿素、总蛋白、钾显著升高。相反，钙水平、胆固醇和白蛋白均显著降低。ALT、ALP、AST和胆红素水平的升高意味着肝脏疾病，而尿素和肌酐水平的升高则意味着肾脏疾病。白蛋白水平降低是由于病肝不能产生白蛋白。这导致了毛细血管的完整性受损和组织的充血和水肿。血象显示红细胞，血红蛋白，红细胞压积，红细胞平均血红蛋白浓度和血小板水平显著降低都意味着贫血。贫血的特征还在于红细胞和白细胞代偿性升高。也有大量嗜酸性粒细胞增多，以抑制ANC的全身性传播。

 

组织病理学：肝中存在的颗粒状病变，心脏的充血和肾脏和多形核细胞浸润，肺泡间隔相关的增厚，脾脏的白髓减少、皮质骨和骨小梁的骨退化。远离注射部位的卵巢和皮肤组织，被观察到是正常的。

 

临床观察与眼科学：在实验结束时没有动物出现死亡。但毒性组大鼠呈剂量依赖性毒性体征。随着实验进展有，厌食，粗糙的毛发，嗜睡和呼吸困难、发烧、心动过速和眼睛毒性的迹象。眼睛毒性表现为角膜和结膜的坏死性病变，坏死导致双眼周围出现光晕。

器官对体重比率的评价：高毒组（5900 mg/kg）大鼠肺重量显著降低。

 

血液学和血清生化：雌性中剂量组（590／m2）和高（5900／m2）毒性组血清生化指标：ALT、ALP、AST水平显著升高，与肝病有关。中等剂量和高剂量肌酐和尿素水平稳定。低血清组（59／m2）的血清生化指标无显著性差异。雌性中剂量组（590／m2）和高（5900／m2）毒性组红细胞、血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均血红蛋白浓度显著减少。两种剂量也与血小板减少有关。雄性中剂量（590毫克/公斤体重）和高剂量（5900毫克/平方米）毒性组也观察到类似的趋势。雌性高剂量组（5900毫克/平方米）和雄性中剂量（590毫克体重）及高剂量（5900毫克/平方米）组也有显著的嗜酸性粒细胞增多。低剂量组性别对血象参数没有显著影响。

 

大体病变和组织病理学：高剂量组有明显的脾，肝肿大。肝肿大还与脂肪浸润有关。毒性组的内脏和骨组织病理病变的严重程度有剂量特异性，而性腺没有明显的病变。肝脏中有明显的脂肪细胞，原因是肝脏不能代谢脂肪，肝损害的特征。脾脏红髓、白髓界限消失由于白色的浆细胞消失，有巨噬细胞和巨细胞浸润。肾表现为多灶性间质性浸润。肾小球轻度异常。有明显的变性和空泡变性，肾小管坏死。肺内有广泛的淤血和渗出物。胫骨近端肢体显示细胞和破骨细胞数量明显增加，但不相应增加成骨细胞数量。导致了明显的小梁和皮质吸收。心脏和性腺无明显病变。

 

中剂量组肝脏表现为广泛性轻度变性，无坏死。脾脏可见大量巨噬细胞浸润和白髓区消失。肾脏有轻度的多灶性肾小管变性和坏死。肾小球轻度异常。肺部表现为局部充血渗出，引起间质浸润肺泡间隔厚度随之增大。粘膜相关淋巴组织（MALT）细胞也有轻度增生。胫骨近端肢体表现出细胞，破骨细胞的适度增长和相关的骨和皮质骨吸收。心脏和性腺无明显病变。

 

低剂量组巨噬细胞抑制和扩散到肝脏，也有中性粒细胞浸润。脾白髓区消失。肾小管广泛变性，无肾小管坏死。胫骨近端轻度小梁破坏，皮质厚度正常。肺、心脏和性腺无明显病变。