1 氟他胺诱导小鼠尿道下裂模型

(1)复制方法  年龄为10周龄的清洁级昆明小鼠，将动物隔夜雌雄合笼饲养，至次日上午，观察到阴栓后雌鼠单笼饲养，并作为妊娠期第1日；待妊娠第15日时，开始给小鼠经口灌胃氟他胺(Flutamide)，给药前将氟他胺药片研成细粉，将所给药物溶入0.4ml蒸馏水中，连续给药5d，给药剂量分别为133.3mg/kg体重、200.0mg/kg体重、266.7mg/ kg体重及333.3mg/kg体重，停药后待其自然分娩。于仔鼠出生后第21日，将雄性小鼠挑出，分别用肉眼及解剖镜观察各剂量组雄性小鼠外生殖器的形态变化，按以下四个等级判定：0级：未发生畸变，外生殖器突起大小及形态基本正常，无明显裂痕；1级：轻度畸变，生殖器突起顶部出现明显裂口，外观呈“M”形；2级：中度畸变，生殖器突起明显变小。有裂痕，阴囊部生毛，睾丸不外突，隐睾，呈雌性外观；3级：重度畸变，生殖器突起完全向后方裂开，尿道口开向肛门侧，隐睾并形成假阴道样凹陷结构。

(2)模型特点  模型动物外生殖器形态观察结果显示，133.3mg/kg体重的剂量组雄性小鼠外生殖器形态无明显异常；200.0mg/kg体重的剂量组雄性小鼠外生殖器突起，顶部发生明显裂口，畸形率可达86.6％，但主要是轻度畸变；而266.7mg/kg体重的剂量组雄性小鼠外生殖器形态与雌性小鼠非常相似，阴囊部生毛，睾丸不外突呈隐睾状，畸形率达到83.3％；333.3mg/kg体重的剂量组雄性小鼠外生殖器突起向后完全裂开，在肛门侧形成一个类似阴道的结构，均表现为明显的中、重度畸变。观察结果经统计分析表明：模型小鼠从受孕后第15日开始，给其灌胃口服200.0～333.3mg/kg体重的剂量氟他胺，连续给药5d，可造成80％以上的雄性小鼠出现先天性尿道下裂。本模型制作方法简便，造模时间短，耗费低廉，成模率高。

(3)比较医学  尿道下裂作为临床常见的先天性发育异常疾病之一，近年来发病率有不断上升的趋势。建立理想的先天性尿道下裂动物模型可为该病的发病机制及药物治疗等方面的研究提供有价值的实验材料。导致该病发生的因素有环境因素、内分泌因素及基因因素等。本模型制作方法根据雄激素受体干扰的原理，采用给动物灌服氟他胺干扰体内雄激素的正常作用，可成功复制出先天性尿道下裂小鼠模型。由于雄性小鼠外生殖器和尿道在胚胎期第17日开始发育，至第19日发育完成；在此期间，睾酮及其代谢产物双氢睾酮(DHT)作为小鼠机体两种重要的雄激素，对雄性动物外生殖器的分化起着非常重要的作用。但这种作用必须通过体内雄激素受体(AR)来介导，靶细胞内AR功能正常，才能保证雄激素效能的正常表达。因此雄性动物(人)生殖器的分化和发育与AR密切相关。模型制作过程中采用的氟他胺是一种雄激素受体拮抗剂，在雄性胎鼠外生殖器和尿道发育阶段，给孕鼠过量的氟他胺，可以干扰雄激素发挥作用，导致雄性幼鼠发生先天性尿道下裂。本模型可用于临床上尿道下裂发病机制和药物治疗方面的研究。

2 己烯雌酚建立尿道下裂大鼠模型

(1)复制方法  体重为200～250g成年大鼠，将动物隔夜雌雄合笼饲养交配，至次日上午，观察到阴栓后雌鼠单笼饲养，将此作为妊娠期第1日。将己烯雌酚(DES)片剂研磨成粉，用生理盐水配制成DES悬液1.5ml，管喂时振荡摇匀。待妊娠12～17d时，经口按100μg/kg体重的剂量灌服 DES 1.5ml，每天1次，共灌服6次。孕鼠妊娠至21d，待其自然分娩后，即对新生大鼠点数，并在放大镜及解剖显微镜下观察新生大鼠的阴茎包皮外观、尿道口位置、排尿情况、称体重和测量肛生殖距离(AGD)，判断有无尿道下裂畸形产生，并拍照。

(2)模型特点  注射DES可诱导雄性仔鼠发生尿道下裂畸形，模型发生率约为30％。正常新生雄性仔鼠其尿道开口于阴茎顶端，且包皮完整，受刺激时排尿可以成线状。而尿道下裂畸形的新生雄性仔鼠其尿道开口于阴茎与会阴交接处或阴茎体腹侧，并伴有阴茎腹侧包皮分裂，龟头外露。此外，有些尿道下裂仔鼠的尿道开口于阴茎体腹侧或阴茎根部，与人类阴茎体型尿道下裂或会阴型尿道下裂相似。模型雄性仔鼠的AGD较正常仔鼠缩短，提示DES对官内雄性胎鼠有雌性化的作用。同时DES作用下雄性仔鼠体重明显较正常仔鼠降低，其原因可能是DES阻碍了雄激素对胎仔重要的正氮合成作用，因为孕中后期是宫内胎仔体重增长迅速的时期。

(3)比较医学  尿道下裂是临床小儿外科常见的先天性畸形疾病之一，其发病率呈上升趋势，目前其发病原因及发生机制仍未阐明。因此，建立与临床小儿先天性尿道下裂类似的动物模型，具有十分重要的临床研究价值。本模型应用自然发生畸形率低的大鼠，通过妊娠期给孕鼠灌服DES的方法，可成功制备出新生雄性仔鼠尿道下裂大鼠。模型方法简单，时间短，耗费低廉，容易观察。与小鼠相比，大鼠自然畸胎发生率很低，且自然受孕率较小鼠高，对药物耐受力较强，同时大鼠仔鼠体积较小鼠仔鼠大，诱导出的仔鼠畸形更容易观察。本模型较小鼠尿道下裂模型更容易观察和操作，是研究尿道下裂发病机制及防治措施的良好动物模型。

3 邻苯二甲酸二丁酯诱导尿道下裂大鼠模型

(1)复制方法  体重220g左右雌性成年大鼠，将其与雄性大鼠隔夜合笼交配，于次日清晨观察有无阴栓，将见到阴栓日作为妊娠第1日，然后雌鼠单笼常规饲养，自由饮水与进食。将邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)按500mg/kg体重加入精制大豆油中；自孕鼠妊娠第12～19日连续每天经口灌胃1次；灌胃容积均为每天1ml/只；然后让孕鼠妊娠期满自然分娩，待仔鼠出生后70d时(大鼠性成熟期)，逐个检查雄鼠的阴茎长度、弯曲度、尿道开口部位，并用带测微计的显微镜测量肛门至生殖器之间的距离(AGD)，判断有无尿道下裂。并将部分孕鼠在第19日行剖宫手术取仔代雄鼠的睾丸组织，用逆转录－聚合酶链反应(RT- PCR)的方法检测睾酮合成过程中限速酶细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450SCC)、3β羟基类固醇脱氢酶(3β- HSD)和细胞色素P45017(a-羟化酶(P450c17)的mRNA含量水平。

(2)模型特点  模型雄性仔鼠尿道下裂发生率明显增加，与正常雄性仔鼠相比统计学差异。尿道下裂判断标准：正常雄性大鼠的尿道开口于阴茎顶端，包皮完整，受刺激时排尿可以成线状；而雄性尿道下裂大鼠其尿道开口于阴茎与会阴交接处或阴茎体腹侧。并伴有阴茎腹侧包皮分裂，龟头外露。表明一定剂量的DBP可造成大鼠出现尿道下裂。孕鼠妊娠第12～19日时，宫内仔代雄鼠的泌尿生殖系统开始形成发育，此时用DBP(500mg/kg体重)剂量灌胃可以最大限度地诱导尿道下裂的发生，并最小限度地减少胎死率。 DBP诱导的尿道下裂组胎鼠睾丸组织中P450SCC、3β-HSD和P450c17的基因表达水平较正常胎鼠均有不同程度的下降，具有统计学差异。结论DBP通过在性发育期干扰仔代雄鼠睾丸组织中睾酮的生物合成途径，降低了睾酮水平，导致大鼠出生后尿道下裂的出现。

(3)比较医学  尿道下裂(Hypospadias)是临床上一种因前尿道发育不良而导致尿道开口达不到正常位置的阴茎畸形，常并发阴茎下屈，它是小儿泌尿疾病常见的先天性畸形，主要见于男性，近年来本病有逐年上升的趋势。尿道下裂患者由于其生殖器外观和排尿方式的异常，给患儿的生理及心理发育带来严重影响；同时本病还常合并其他畸形如隐睾、斜疝等，导致患者成年后性生活困难，给患儿及家庭的生活带来严重影响。由于尿道下裂畸形的发病原因非常复杂，其发病机制仍未阐明，环境污染物作为尿道下裂发病率升高的某些因素之一，已得到公认。

DBP作为广泛存在于人们日常生活及生产中的一种价廉实用的增塑剂，也是一种环境污染物，它属于环境内分泌干扰物中抗雄激素一类，作用机制类似氟他胺，但不完全相同。DBP对动物具有明显的睾丸毒性、胚胎毒性和致生殖畸形等，它可导致机体睾酮水平明显下降，造成睾丸、附睾、附属性腺及外生殖器等出现睾丸萎缩、隐睾、附睾发育不良甚至缺如、尿道下裂等雄性生殖系统病理性损害。除采用氟他胺、DES及DBP能导致动物发生尿道下裂外，苯甲酸酯和阿司匹林也可以诱导小鼠尿道下裂畸形。由于临床尿道下裂患者常伴有体内性激素尤其是雄激素代谢异常，所以尿道下裂模型多与药物影响动物机体内的激素水平有关。尿道下裂不仅是机体局部表现的畸形，也是内分泌系统病变的局部表现；药物诱导尿道下裂可能主要是宫内胎仔腹侧尿道上皮细胞发育时，其凋亡和增生活动改变的结果。因此，诱导尿道下裂的定位与药物暴露时的胎龄密切相关。采用DBP诱导建立的大鼠尿道下裂模型，为临床上小儿先天性尿道下裂的病因学研究及环境污染因素与尿道下裂发病率之间的关系提供了科学的动物实验依据。