来自中科院上海生命科学研究院，上海交通大学医学院健康科学研究所的研究人员筛选到一条在ES细胞分化过程中重要的信号通路calcineurin-NFAT,  并且对其在ES细胞分化和小鼠胚胎早期发育过程中的功能进行了深入研究。这一研究成果于2011年一月发表在干细胞领域国际顶尖期刊《Cell  Stem  Cell》杂志上。

领导这一研究的是中国科学院干细胞生物学重点实验室金颖研究员，其早年毕业于中国医科大学，在获得北京协和医科大学/中国医学科学院的博士学位后远赴美国求学，曾在美国北德克萨斯州大学医学中心和德克萨斯大学西南医学中心进行博士后研究工作，2000年回国。

金颖研究员的研究组近年来在胚胎干细胞研究领域获得了颇多成果。这项发表于《Cell  Stem  Cell》杂志上的最新研究成果是由金老师的两名博士研究生，李翔和朱莉莉，主要完成的。其研究成果对ES细胞分化和小鼠胚胎早期发育过程中的功能等干细胞研究基础问题提出了新的看法，有助于更深入的了解ES细胞自我更新与分化。为了详细了解这一成果，生物通特联系了金颖老师，就读者感兴趣的一些问题请教了她的研究组。

生物通：干细胞研究风生水起，然而对于一些比较基础的机制机理问题，目前却了解的不多，贵研究组《Cell  Stem  Cell》文章解答了胚胎干细胞如何从自我更新向分化状态转变的一个关键信号问题，意义重大，您能谈一下这项研究的研究思路吗，为其他科研人员提供参考？

金老师研究组：胚胎干细胞（Embryonic  Stem  Cells,  ES）是由着床前囊胚内细胞团（Inner  Cell  Mass,  ICM）的细胞在体外分离培养所建成的全能性细胞系。它具有自我更新和发育多能性的特点。这两大特性使ES细胞具有极其重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景。目前的研究表明，  外源性LIF-STAT3和BMP-SMAD通路对于ES细胞维持自我更新具有至关重要的作用。在没有其他因子存在的无血清培养基中，仅仅添加LIF  （leukemia  inhibitor  factor）  和BMP4  （bone  morphogenetic  protein  4）  两种因子便可成功的在体外培养ES细胞。然而调控ES细胞胚层分化的分子机制目前研究不是很清楚，研究表明激活ERK-1/2通路可以触发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条通路可以不依赖LIF部分维持ES细胞自我更新。但除了ERK-1/2通路以外，是否有其他信号通路参与调控ES细胞胚层分化目前并不清楚。

为了寻找调控ES细胞胚层分化的未知通路，我们应用了PB转座子这一突变筛选工具。我们发现当PB转座子突变ES细胞内源基因Ppp3r1后，在撤去LIF诱导ES细胞分化条件下，ES细胞不进行正常的胚层分化，而能维持自我更新状态。这提示基因Ppp3r1在调控ES细胞胚层分化方面可能有重要作用。Ppp3r1是钙调神经磷酸酶（calcineurin）的一个调节亚基(CnB)。Calcineurin是一个丝、苏氨酸磷酸酶。它可以使下游基因活化T细胞核因子(nuclear  factor  of  activated  T  cells，NFAT  )去磷酸化、被激活进入细胞核。  在本文研究中，利用calcineurin-NFAT信号通路抑制剂和RNA干涉（RNA  interference，RNAi）等方法表明，calcineurin-NFAT信号通路的激活对促发ES细胞和早期胚胎进行胚层分化是充分而且必需的。机制上，它和Erk1/2通路共同激活下游靶基因Src，进一步促进上皮-间充质细胞转换（epithelial-mesenchymal  transition，EMT）。而EMT很可能是ES细胞早期胚层分化必经的过程。

生物通：研究发现Calcineurin-NFAT信号通路存在于许多组织器官中，也与一些疾病相关，比如心肌肥厚，贵研究组的最新成果发现这一信号通路在胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化中的调控作用，这与这一通路的其它功能有何关联呢？

金老师研究组：Calcineurin-NFAT信号通路在调控胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化和心肌肥厚的作用机制上有一定的相似性。由于转录因子NFAT  DNA结合能力较弱，通常和其他转录因子共同激活下游基因。其中ERK/MAPK信号通路下游的AP-1家族蛋白是最常见的共同激活因子。在心肌肥厚疾病模型中Calcineurin-NFAT和ERK/MAPK信号通路共同激活下游基因引起心肌肥厚。而在调控胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化的过程中Calcineurin-NFAT和ERK/MAPK信号通路同样协调作用。

生物通：这项研究除了发现关键调控信号通路，而且还确定了决定干细胞命运的关键调控因子Src，这一调控因子的具体作用是什么呢？

金老师研究组：基因Src是一个非受体络氨酸激酶。文献报道Src在调节细胞迁移延伸方面有重要作用。我们研究发现calcineurin-NFAT信号通路和Erk1/2通路共同激活下游靶基因Src促进ES细胞进行胚层分化。在ES细胞中过表达Src的活性形式可以快速诱导ES细胞发生分化，引起多能性标志基因显著降低，而分化标志基因，特别是滋养层和原始内胚层明显提高。而抑制基因Src活性可以完全阻断calcineurin-NFAT信号通路引起的细胞分化。机制上基因Src通过可以诱导上皮-间充质细胞转换（epithelial-mesenchymal  transition，EMT）引起ES细胞发生分化。

生物通：在这项研究中，贵研究组主要采用了哪些实验技术呢，您认为其中的难点在哪里？

金老师研究组：我们主要运用了以下实验技术：  胚胎干细胞培养和分化（ES  cell  culture  and  differentiation）；基因芯片(micro-array)；实时定量PCR；染色质免疫共沉淀(Chromatin  immunoprecipitation  assay，ChIP)；荧光素酶报告基因实验(Luciferase  Reporter  Assay)；免疫印迹分析(Western  blotting)；电泳迁移率变动实验(EMSA)；免疫荧光染色分析(Immunoflourescence  staining)；  嵌合胚胎实验(chimeric  embryo  Assay)  等技术。

技术难度在于如何通过基因芯片和生物信息学寻找calcineurin-NFAT信号通路的下游基因。为了寻找Calcineurin-NFAT信号通路调节的下游基因，我们进行了NFAT信号通路抑制和激活情况下的生物芯片研究，发现168个基因受NFAT通路上调控，138个基因受NFAT通路下调控。我们将这些基因进行信号通路分析，发现焦点粘附和细胞骨架调节通路受NFAT调节最为显著。为寻找NFAT直接下游基因，我们将上述两个信号通路中的基因的启动子进行NFAT和其常见共同因子AP-1的结合位点预测。我们发现基因Src启动子区域含有保守的NFAT和AP-1结合位点，从而通过一系列实验证明Src的确是Calcineurin-NFAT信号通路在调控ES细胞分化过程中起作用的主要下游基因。