基因敲除(gene knockout ) 是 80年代初出现的一项新的基因工程技术, 是制备转基因动物的重要技术之一。利用该技术可以培育先天缺陷某一特定基因的动物, 以此研究该特定基因的生理功能或在疾病发生发展中的意义。近年来基因敲除小鼠在药物依赖性研究中也得到广泛的应用。在传统的药物依赖性研究中, 往往选取特异性的受体配体来研究该受体在依赖性中的作用, 但这种特异性往往是相对的 ,剂量改变就可能影响其它受体的功能,所以难以真正确定该受体的作用。而基因敲除技术在这方面具有独特的优点, 因为利用基因敲除技术可以选择性敲除某一特定受体基因, 获得先天缺陷该受体基因的小鼠,通过比较基因缺失动物(本文简称 KO型) 和野生型动物(本文简称 WT 型) 在依赖性模型上的行为差别 , 可以准确判断该受体所发挥的作用。可以说, 基因敲除技术的发展为药物依赖性研究带来了一场新的革命。本文综述了近年来这一方面的研究进展。

 

1 基因敲除技术简介

 

基因敲除是通过人为干预达到抑制或灭活目的基因表达的分子生物学技术。它采用同源重组方法(homologous recombinat ion)用突变的基因删除(取代)相应的正常基因, 或用正常基因敲除相应的突变基因, 从表达水平或转基因动物的表现型来研究正常基因的功能和突变部位的作用。利用基因打靶 (gene target ing) 技术获得基因敲除动物是其中的一种方法, 其步骤是使胚胎干细胞内的目的基因进行定点突变 (基因打靶) , 将打靶后已定点突变的胚胎干细胞注射到宿主胚泡中, 再将胚胎植入假孕母体的子宫内,使其发育成目的基因缺陷 (突变) 的杂合的种系嵌合体, 将其自交后再筛选出目的基因缺陷型的纯合子即基因敲除动物。通过分析基因敲除动物体内单基因缺陷所产生的表型异常来研究基因调控和功能, 建立疾病的动物模型以及进行基因治疗等。

 

2 敲除阿片受体基因

 

阿片受体是阿片类物质直接作用的受体, 不仅在介导阿片类镇痛中发挥重要作用, 而且也与精神活药物物的依赖性有关。阿片受体分为μ、δ和κ等几种亚型,目前 ,已经培育了μ、κ和δ受体缺陷的小鼠 ,为研究μ、κ和δ受体在药物依赖性中的作用提供了很好的实验模型。

 

2. 1μ阿片受体

 

μ受体基因敲除小鼠, 其后代符合孟德尔遗传规律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %杂合子, 24. 8 %的纯合子 , 说明突变的μ受体基因缺陷小鼠没有发生宫内和出生后死亡。这种小鼠的生长、发育、生殖和活动周期等与正常小鼠无明显差异。放射配体结合实验显示 ,μ受体 KO 小鼠没有任何μ受体存在,但δ和κ受体的数量和分布未受影响[2 ]。

药物是选择性较高的μ阿片受体激动剂, 其对WT小鼠有很强的镇痛作用, 但在μ受体 KO小鼠不出现镇痛。在浸尾、甩尾和热板法镇痛试验中,对μ受体KO小鼠皮下注射药物达到 50 mg·kg- 1,鞘内或脑室内注射药物剂量达到WT小鼠镇痛ED50的15倍都不产生镇痛作用。表明μ阿片受体基因编码的受体对介导药物在痛通路中的作用是必须的。在同样实验条件下,药物在κ、δ受体KO小鼠仍有镇痛作用, 证明了κ和δ受体不参与介导药物镇痛。用条件性位置偏爱方法评价药物的欣快效应证明药物(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠产生 CPP 效应 ,而在μ受体 KO 小鼠不能引起 CPP 效应。慢药物物给药使 WT 小鼠形成身体依赖性, 纳洛酮诱发其出现戒断症状, 同样处理μ受体 KO 小鼠不出现戒断症状。重复药物给药使 WT 小鼠脑内腺苷酸环化酶的活性上调, 而在μ受体 KO 小鼠脑不产生腺苷环化酶活性上调 [3 ], 说明药物产生的精神依赖性和身体依赖性是μ阿片受体介导的, μ阿片受体基因编码的产物是药物药理效应的既定的分子靶位。

 

2. 2κ阿片受体

 

κ受体 KO 小鼠的自发活动与 WT 小鼠无差别。κ受体激动剂 U50488H 在κ受体 KO 小鼠不引起镇痛作用 , 也不形成条件性位置厌恶效应, 而在WT 小鼠出现,表明κ受体在κ激动剂作用中的重要性。药物在κ受体 KO 小鼠的镇痛作用和条件性位置偏爱效应与 WT 小鼠无差别, 但药物的戒断症状则明显弱于 WT 小鼠, 说明κ受体不参与药物的镇痛和奖赏效应, 但参与调节药物的身体依赖性[4 ]。

 

2. 3δ阿片受体

 

在δ阿片受体基因敲除小鼠,δ受体激动剂DPDPE 的镇痛作用在脊髓水平明显减弱, 但在脊髓上水平的镇痛作用与野生型无差异, 说明δ受体在不同部位的镇痛效应中所起的作用不一样。实验还发现δ受体敲除小鼠不对药物的镇痛作用产生耐受性 [5 ], 但δ受体敲除小鼠在依赖性中的作用还有待于进一步研究。

 

3 敲除多巴胺受体或多巴胺递质转运体基因

 

多巴胺 (DA) 系统是药物精神依赖性的神经基础, 中脑边缘DA 系统是“奖赏系统”中最重要的一环。DA 受体亚型有两类: D1 样 (D1 和D5 受体) 和D2样(D2、 D3 和D4 受体) ,不同的DA 受体亚型在药物奖赏中发挥的作用也不相同。利用基因敲除技术已经培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受体缺陷的实验小鼠,为探讨DA 受体在药物奖赏效应中的作用提供了依据。

 

3. 1 D1 受体

 

D1 受体 KO 小鼠基础性活动多于 WT 小鼠。可卡因能使 WT 小鼠活动增加,而不能使D1 受体 KO小鼠活动增加, 但可卡因的位置偏爱效应在两种小鼠都出现[6 ]。苯丙胺反复给药的行为敏化现象在D1 受体 KO 小鼠低于 WT 小鼠; 苯丙胺在D1受体KO小鼠和WT小鼠都形成自身给药, 但 KO 小鼠的阳性反应率低于 WT 小鼠[7 ]。这些实验说明D1 受体激活可能是可卡因、苯丙胺运动增强效应所必需的,而不是奖赏效应所必需的。但这与正常 WT 型的实验结果不一致, 因为在正常鼠, D1 受体拮抗剂可抑制药物的自身给药和偏爱效应。造成这种不一致的原因可能与受体拮抗剂的特异性有关, 也可能与基因敲除小鼠的遗传异常有关。

 

3. 2 D2 受体

 

在阿片类诱导的运动增强效应实验中, D2 受体KO 小鼠对内源性和外源性阿片类物质诱导的运动增强效应与 WT 小鼠无显著性差异, 表明 D2 受体缺失未影响阿片诱导的运动增强效应。在药物身体依赖性实验中,D2 受体 KO 小鼠和 WT 小鼠的戒断症状没有明显差别,说明 D2 受体在阿片身体依赖性中不起重要作用。在位置偏爱实验中, D2 受体 KO小鼠不对药物形成偏爱效应, 但对食物形成偏爱效应 ,说明 D2 受体在精神依赖性中起重要作用; 并且药物奖赏和自然奖赏效应的机制可能不同[8 ]。

 

3. 3 D3 受体

 

与WT小鼠相比,D3受体KO小鼠的基础活动增加 ,低剂量的可卡因可D3受体KO小鼠活动增加 ,但在高剂量下与 WT 型无差别。D3受体KO小鼠对苯丙胺的偏爱效应更敏感, 因为很小剂量的苯丙胺就能使其形成位置偏爱。Xu[9 ]认为正常情况下D3受体可能起着对抗D1和D2受体的作用,在D3受体KO小鼠 ,这种 D3 受体的对抗作用没有了,使苯丙胺的作用更加明显,较小剂量就能发挥效应。

 

3. 4 D4 受体

 

D4 受体 KO小鼠基础活动降低, 对D4受体激动剂氯氮平的敏感性也降低,但乙醇、可卡因、药物基苯丙胺使D4受体KO小鼠活动增多[10 ],其机制还不清楚。关于D4受体KO小鼠的依赖性特性还缺乏研究资料。

 

3. 5 DA 转运体

 

DA 转运体(dopamine t ransporter , DAT)位于突触前膜,重摄取突触间隙中的DA进入神经末梢,是终止DA生理效应的主要方式。DAT KO小鼠体重增长缓慢,成熟之前易死亡,但生殖能力旺盛,母鼠分娩后缺乏哺乳行为。该自发活动明显增加, 但对可卡因和苯丙胺的运动增强或刻板活动特性反应减弱 , 说明 DAT 是可卡因和苯丙胺的作用靶位点。在依赖性实验中,可卡因使 WT 型和 DAT KO小鼠都形成静脉自身给药和偏爱效应[11 ],药物同样可使 KO 型形成偏爱效应[12 ]。与之相矛盾的是,在正常鼠 ,DAT 阻滞剂可以抑制可卡因的自身给药。

 

3. 6 囊泡单胺转运体

 

囊泡单胺转运体 (vesicular monoamine t rans2porter , VMAT) 的作用是将单胺类从细胞浆转运至囊泡储存,分为1型和2型, VMAT2 主要分布于神经末梢,对DA、组胺、5 - HT 等单胺类特异性较高。Wang 等[13 ]培育了VMAT2基因缺陷小鼠, 发现该小鼠成活率低, 出生后几天内即死亡, 以后的实验只能用杂合子和 WT 型进行。在杂合子小鼠,纹状体 DA 浓度很低, K+和苯丙胺诱发的DA 释放作用也降低, 说明在杂合子 VMAT2 的功能也受到影响。实验发现,杂合子小鼠对可卡因、苯丙胺和乙醇的运动增强效应比 WT 型更敏感; 苯丙胺诱发WT 型产生偏爱效应, 而不诱发杂合子产生偏爱效应[14 ]。这些结果反映 VMAT2 参与维持药物的奖赏效应。4 敲除 5 - HT受体和 5 - HT转运体基因研究表明 5 - 羟色胺(5 - HT) 系统参与调节药物的奖赏效应, 但目前只培育了 5 - HT1B 受体 KO小鼠和 5 - HT 转运体 KO 小鼠。

 

4. 1 5 - HT1B 受体

 

在 5 - HT1B受体KO小鼠,可卡因累进比率自身给药实验中的“终点”(break point )明显高于WT小鼠,对食物形成的强化效应在两种小鼠相同,表明5 - HT1B 受体KO小鼠对可卡因更易形成自身给药。

 

在 5 - HT1B 受体KO小鼠,可卡因诱发的自发活动和刻板运动强于WT型; 慢性给可卡因, WT的刻板运动逐日增加, 而5- HT1B受体KO小鼠从d2起不再增加; 由此可见, 5 - HT1B 受体KO小鼠对可卡因引发的自发活动增强更敏感, 而WT小鼠对可卡因的刻板运动更敏感。一般认为, 黑质纹状体DA 系统与刻板运动有关, 中脑边缘DA系统与自发活动和奖赏效应有关。因此, 以上实验说明在5 - HT1B 受体 KO 小鼠 , 中脑边缘 DA 系统的活动更为突出。免疫组化实验显示,KO 型小鼠伏隔核的△FosB 等 Fos 相关抗原表达增强,这种增强在 WT小鼠慢性给可卡因时出现, 说明5 - HT1B受体 KO小鼠遗传上的特点与 WT 小鼠慢性给可卡因出现的变化相似。因此, 兴奋剂对5 - HT1B 受体KO小鼠更易产生奖赏效应[15 ]。但最近却发现相反的结果,可卡因不能使 5 - HT1B 受体 KO 小鼠形成位置偏爱效应[16 ]。结果不一致的原因有待于进一步研究。4. 2 5 - HT 转运体5 - HT转运体(serotonin t ransporter ,5 - HTT)位于 5 - HT 神经元的突触前膜,重摄取突触间隙中的 5 - HT 进入神经末梢。在5 - HTT KO 小鼠模型上 , 可卡因仍能形成偏爱效应, 说明 5 - HTT 的缺失不影响可卡因的奖赏效应[11 ]。

 

5 敲除 CB1 受体基因

 

大麻受体分为CB1和CB2型受体 , CB1型受体主要分布于神经系统 ,与大麻的精神作用有关。Ledent等[17 ]培育了CB1受体KO小鼠。对WT型及CB1受体KO小鼠都给予△9- THC , 发现其镇痛、活动减少、体温降低、血压下降、戒断反应及自身给药等作用在 WT 小鼠出现,而在 CB1 受体 KO 小鼠不出现 , 说明大麻类的主要药理学特性是由CB1受体介导的。

 

若将两种鼠都用阿片类处理, 发现药物急性给药的镇痛、降温作用和多次给药的镇痛耐受现象,以及 U50488H 的镇痛和活动减少效应在两种鼠没有差别。但与 WT 型相比 ,CB1 受体 KO 小鼠的药物戒断症状明显减轻,药物自身给药现象明显减弱,也不对 U50488H 形成条件性位置厌恶效应, 说明阿片类的身体依赖性和精神依赖性都与CB1 受体有关。另有实验发现, 在 CB1 受体 KO 小鼠 , 药物不能引起伏隔核DA 释放[18 ],说明 CB1 在药物促伏隔核DA释放中发挥一定作用。

 

6 敲除一氧化氮合酶基因

 

在神经系统,一氧化氮(NO)可作为一种信息传递物质参与脑内多种生理功能。近年来证明,NO 参与药物耐受和依赖, NO合酶(NOS)抑制剂可减轻阿片的戒断症状。而敲除 NOS 基因的小鼠对可卡因的运动增强和行为敏化反应减弱, 对可卡因也不形成位置偏爱[19],进一步验证了NO在药物奖赏效应中的作用。

 

7 其它

 

不同实验室还培育了许多敲除其它基因的转基因动物 , 其中有些做过与药物依赖性有关的实验。如: 可卡因急性给药可诱导正常鼠前皮质组织纤溶酶原激活因子 (t issue plasminogen act ivator, t PA)表达, 在KO小鼠 ,可卡因的活动增强和行为敏化效应比WT型强; KO和WT 型都能形成可卡因的自身给药, 但形成自身给药后如果只给信号刺激不给可卡因, WT型压杆率降低 , 而KO型压杆率不降低,说明tPA在依赖性中可能发挥比较特殊的作用[20 ]。再如:尼古丁可刺激WT小鼠纹状体释放DA ,而在敲除N型胆碱受体β2亚单位的小鼠,尼古丁就没有这种作用。说明N受体参与尼古丁的精神依赖性[21]。最近发现敲除P物质受体,药物的戒断症状和奖赏效应都减弱[22 ]。

 

8 结语

 

利用基因敲除技术选择性敲除某特定基因, 为研究该特定基因在依赖性中作用提供了直接依据。利用该模型研究各种递质受体、转运体以及各种代谢酶在依赖性中的作用已经取得了一定进展。这种实验方法特异性高, 避免了受体拮抗剂特异性低的缺点 ,可以“真实”地体现目的基因的活动特性。但任何事物都有两重性,有优点 ,也有缺点。转基因动物通过基因改造造成了动物先天的遗传异常, 生长发育过程中可能会发生一些意想不到的变化, 况且一种基因敲除了,其它基因功能可能代偿性增强,这就为解释实验结果增加了困难, 这也可能是在有些转基因动物上取得的结果与在正常动物上用特异性拮抗剂取得的结果不一致的原因之一。目前正在发展中的条件性基因敲除技术可以在成年鼠使某一基因突变 , 从而避免了发育过程中的遗传缺陷。相信在不久的将来,随着各种技术的成熟,利用转基因动物研究药物依赖性的机制乃至筛选治疗药物都将得到进一步发展 。