摘要：越来越多的证据集中在线粒体紊乱对抑郁症发展的影响上，但是关于抗抑郁药长期服用对大脑线粒体蛋白谱的影响的数据却很少。本研究的目的是探讨一种非典型抗抑郁药噻奈普汀对线粒体的影响。基于高架十字迷宫和强迫游泳试验，大鼠暴露于产前应激程序显示抑郁和焦虑样。慢性噻奈普汀给药后，双向电泳结合质谱显示产前应激大鼠大脑结构的变化。2-酮戊二酸、琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基，异柠檬酸α亚基，在海马中的表达上调。在额叶皮质，在谷氨酸脱氢酶和细胞色素bc1复合体亚基2的表达显著增加。这些研究结果表明，线粒体是治疗干预的目标，线粒体功能可能是有效治疗应激相关疾病的关键。

 

 

简介：公认的抑郁症理论是基于单胺类传输理论，免疫系统功能紊乱，神经营养因子功能弱化，下丘脑-垂体-肾上腺轴运动亢进。最近，另一个有趣的理论被称为“线粒体功能障碍假说”。线粒体功能受损，导致能量故障，减少三磷酸腺苷（ATP）的生产，影响钙平衡，自由基的产生和氧化应激增强，导致细胞凋亡过程的开始。此外，中枢神经系统（CNS）线粒体可能控制神经可塑性过程，包括神经分化、轴突、树突重塑和神经递质的释放。一些数据还表明线粒体功能与表观遗传过程相互作用，这些过程在神经精神疾病的发病过程中起重要作用，包括抑郁症状。所有这些观察表明线粒体功能障碍可能是导致抑郁症的代谢紊乱的一个关键因素。抑郁症能观察到以下现象：线粒体形态的改变，线粒体呼吸的减少，线粒体DNA多态性和线粒体DNA突变水平的增加以及核基因和参与线粒体呼吸的蛋白质的下调。此外，电子显微镜数据显示线粒体的数量及其在脑区的分布在这些疾病的发病机制中起着重要的作用。抑郁症患者大脑中高能量磷酸盐含量的降低和pH值的降低通常能被观察到。因此，线粒体可能是治疗干预的一个有趣的靶点。线粒体功能的改善可能是有效治疗压力相关疾病的一个重要组成部分。噻奈普汀，非典型抗抑郁药，抗抑郁药中似乎是最有趣的和有前途的；然而，噻奈普汀作用的分子机制仍有争议。经典的三环类抗抑郁药和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）阻断5-羟色胺再摄取，噻奈普汀是有选择性地提高血清素摄取进入大鼠脑突触体。噻奈普汀可能对谷氨酸系统有影响，逆转应力相关受损神经的可塑性。此外，噻奈普汀抗惊厥和镇痛作用已被假定。到目前为止，只有少数研究噻奈普汀对线粒体的影响。噻奈普汀抑制体外复合体I活性，但其他线粒体复合体、凋亡过程和膜电位减少不受这种药物的影响。母爱剥夺大鼠慢性噻奈普汀的使用造成杏仁核和海马的肌酐浓度和调制线粒体复合物I和呼吸链复合体II／III水平的减少。据我们所知，目前没有关于噻奈普汀对慢性抑郁症的动物模型脑线粒体蛋白表达的影响研究。抑郁症的线粒体病理可能是由于其他原因，早期不良生活经历影响大脑发育。因此，在本研究中，我们使用了一种很好的抑郁症动物模型，即产前应激程序。在这个模型中，观察到了免疫系统和神经内分泌系统的行为紊乱和异常。在本研究中，我们采用双向电泳结合质谱技术研究非典型抗抑郁药噻奈普汀慢性给药对受产前应激影响的大脑区域，即3月龄大鼠雄性大鼠的海马和额叶皮质线粒体蛋白质表达谱的影响。

 

动物：SD大鼠（200-250g）饲喂在标准实验室条件下，每天对雌性大鼠进行阴道涂片，以确定发情周期的阶段。在发情前期，雌性鼠同雄性鼠合笼12 h。第二天早上，阴道涂片中发现了精子。怀孕的雌性动物随机分为对照组和应激组（每组n = 8  ）。

 

应激程序：产前应激过程按先前描述的进行。简单地说，应激组怀孕的雌鼠从怀孕的第十四天开始每天进行三次应激，一直持续到分娩。在上午9点，下午12点，下午5点，老鼠被放置在塑料缸（7/12厘米）和暴露于明亮的光（150 W）为45分钟。对照组怀孕的母鼠在笼子里没有受到打扰。在研究中，只有八到十只幼鼠后代，雄性和雌性数量相同。从21日龄窝中筛选出雄性后代。每只笼中有四只动物（每窝一只到两只）。在3个月龄的时候，对照组和应激组的母鼠的后代进行了第一次行为验证。

 

高架迷宫测试：高架十字迷宫试验，是根据Pellow先前描述的方法对控制组和产前应激组大鼠进行（每组18只）。迷宫被提升到离地面50厘米的高度，只有微弱的照亮灯光。试验前，这些动物被放置在实验室1小时。每只动物被放置在迷宫的中心区域，面对封闭的手臂，观察总共5分钟。结果显示为进入迷宫开放臂和闭合臂的平均数目和每一个迷宫的平均时间。

 

强迫游泳实验：为进一步验证抑郁症动物模型，采用先前描述的方法进行强迫游泳试验。简而言之，动物（n = 18  每组）分别进行试验，在这期间他们被迫在一个装满水的缸里35厘米的高度游泳（25°C）。第一次和第二次试验之间有24小时的间隔。第一次试验持续了15分钟，第二次试验持续了5分钟。对抑郁症动物模型的药理验证，在慢性抗抑郁药物治疗的最后几天，动物再次接受高架迷宫和强迫游泳训练。

 

抗抑郁药：行为验证后，控制和产前应激组后代分为六个实验组（对照 + 赋形剂组，对照 + IMI组，对照 + TIA组，应激 + 赋形剂组，应激 + IMI组、应激 + TIA组；每组六只），用抗抑郁药或赋形剂治疗21天。丙咪嗪（作为比较噻奈普汀效率行为测试的参考药物），噻奈普汀，0.9%生理盐水、腹腔注射，每天一次，上午9:00和10:00。丙咪嗪和噻萘普汀注射，剂量为10毫克/毫升/公斤，体积为1毫升/千克。最后一次注射后二十四小时，处死动物，迅速断头，解剖海马与额叶皮质。从新鲜收获的脑组织中分离出富含线粒体的部分放置在4°C。在250mM蔗糖和1mM EGTA溶液（添加1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物）中匀浆，通过1000 g离心10分钟分离出细胞核和细胞。然后，再次12000G离心  10分钟，上清液是线粒体。然后线粒体浓缩颗粒用3个周期的再悬浮，同质化和离心纯化，（12000 G 15, 20，15分钟）。通过进一步离心上清液获得胞浆部分（4°C，125000 g，90分钟）。

 

凝胶电泳与凝胶图像分析：样品进行了涡旋和25°C孵育30分钟以确保最大的蛋白溶解。取上清液，测定蛋白含量。

 

结果：噻奈普汀对产前应激大鼠焦虑样行为的影响：采用高架迷宫试验评价大鼠焦虑样行为。产前应激过程导致进入开放迷宫的大鼠数目和待在其中的时间显著减少。然而，我们没有观察到进入闭合臂的数目和花费在其中的时间的差异。要确定是否慢性噻奈普汀或丙咪嗪（作为比较的参考药物噻奈普汀）使用影响产前应激诱发的焦虑样行为，我们再次评估高架十字迷宫试验。在第一组实验中，产前应激大鼠，观察到进入迷宫开放臂鼠数目和花在其中的时间显著减少。

 

噻奈普汀对产前应激大鼠抑郁样行为的影响：对大鼠的抑郁样行为，我们进行强迫游泳试验。证实：产前应激作用引起了明显的长时间不动，缩短了游泳和攀爬时间。在下一组的实验中，通过强迫游泳实验，确定慢性噻奈普汀与丙咪嗪对产前应激诱发的行为变化影响。我们观察到不动性的增加和游泳和攀爬时间的减少，这证实了产前应激引起的变化是持久的。我们观察到药物和应激加药物相互作用对不动时间的显著影响。比较发现，丙咪嗪和噻奈普汀缩短产前应激后代的不动时间。丙咪嗪和噻萘普汀增加应激大鼠后代的游泳时间。

 

结论：我们的研究结果清楚地表明，噻奈普汀有效地降低早期不良生活导致的慢性行为障碍。此外，双向电泳结合质谱首次显示慢性噻奈普汀改善抑郁动物模型海马线粒体蛋白质谱的中断。在噻奈普汀长期治疗的产前应激大鼠的额叶皮层，我们注意到与谷氨酸通路和呼吸链有关的蛋白质上调。线粒体可能是精神病学治疗干预的一个关键目标，线粒体功能的改善对于有效治疗压力相关疾病至关重要。