摘要：心脏骤停是全世界死亡和残疾的主要原因。虽然许多受害者初步复苏，他们经常遭受严重的脑损伤，甚至导致“持续性植物状态。因此，有必要探索心脏骤停后恢复和保护脑功能的治疗方法。在本研究中，我们利用斑马鱼斑马鱼为模型，利用活体时移共焦成像技术，发现斑马鱼脑在心搏停止后产生了一个爆发的钙波。Ca2+波首先在后脑发起然后依次传播到中脑和前脑，神经元在Ca2+波传播后出现钙超载。与此一致的是，我们的研究进一步证明心脏停跳斑马鱼神经细胞凋亡增加。全身麻醉剂如咪唑安定或氯胺酮预处理可防止心脏骤停引起的钙波传播。咪达唑仑或氯胺酮预处理能显著降低CA斑马鱼神经细胞凋亡率，提高存活率。总之，这些发现首次证明了全身麻醉药预处理能抑制钙波在斑马鱼体内的传播，从而防止心脏骤停引起的脑损伤。

 

 

简介：心脏骤停（CA）仍然是全世界死亡和持续残疾的主要原因，尽管急救医疗和急诊人工心肺复苏（CPR）得到了巨大的改善。许多受害者初步复苏，但他们往往会受到广泛的后期钙的综合征，包括神经损害，心肌功能障碍，全身炎症反应。脑损伤占CA后残疾的最大比例。许多存活出院的CA患者经历持续性认知损害，严重影响他们的生活质量。迄今为止，还没有有效的药物来保护大脑免受缺血性损伤。虽然治疗性体温过低明显地改善了心室颤动引起的脑损伤，但这些患者的临床效果是相当轻微的，在大多数自发循环的患者中，有20%的患者受益于低温疗法。因此，有必要对脑损伤机制进行解读，并制定治疗方案，以提高CA.的生存和改善生活质量。CA后启动大脑中的复杂级联反应，包括ATP耗竭，活性氧的过度形成，蛋白酶的病理激活，细胞死亡信号，诱导炎症和谷氨酸兴奋性毒性。其中，一些机制在循环停止后数小时到数天执行。目前的研究多集中于促进自发性循环恢复后迟发性脑损伤的恢复。但在CA.早期，没有迅速的治疗干预来减轻脑损伤的程度。利用斑马鱼胚胎模型的脑和心脏的透明度，以及在体内操作的可用性。我们使用转基因TG（HUC：gcamp5）斑马鱼，胞内钙离子动态变化显示神经元活动，应用活体时移共焦成像观察ca在神经元活动中的动态变化。我们首先监测了斑马鱼脑在CA后产生的钙离子爆发波。Ca2+波首先发起在后脑然后依次传播从中脑前脑。神经元在钙离子扩散波后出现钙超载，表明钙离子传播波引起神经元死亡。全身麻醉药预处理可抑制钙诱导的钙离子波。总的来说，全麻药预处理能显著减少神经细胞死亡，提高CA斑马鱼的存活率和运动能力。总之，我们的研究揭示了CA脑损伤后爆发的钙离子波的传播。全身麻醉药预处理可抑制钙诱导的钙离子通道，改善CA.神经系统的预后。

 

方法：斑马鱼心脏停搏模式： 在受精后7天（DPF），在侧卧位无麻醉TG（HUC：gcamp5）转基因斑马鱼被嵌入在1%低熔点琼脂糖。一个玻璃管固定到微操作机器人被用于慢慢按下斑马鱼心脏直到心脏停止跳动。监测躯干和脑血管血流量，评价心跳骤停。光镜下躯干和脑血管血流停止，认为心脏停搏模型成功。心脏停搏时间维持在1小时左右。评估活动或生存率后，钙，玻璃微针去除让心跳恢复。只有成功的心脏跳动的幼虫被用于随后的实验。在对照斑马鱼，只有心包，而不是心脏，被按下。

体内钙成像缩时摄影：时间分辨率为800×800像素的图像在1 - 2赫兹获得。对非麻醉的幼虫进行影像。在建立心搏停止之前，将幼虫成像20分钟作为对照，然后在CA.之后每条鱼进行1小时的成像。对斑马鱼幼虫在室温（26～28℃）进行成像。

 

神经元钙离子活性分析：对时间推移图像进行处理，检测并分析钙波。在第一帧中，在上升阶段波的峰值振幅为5%。根据目视检查确定各波的时间和阈值，以便更好地检测波的边界。

 

药物处理：在建立CA模型之前，斑马鱼用咪达唑仑（0.1 - 0.5mM）或氯胺酮（1 - 2.5 mM）进行5分钟的预处理。为了保持药物的有效浓度，胚胎介质在体内延时成像时涉及到相应的药物。为了评估运动功能或存活率，在体内延时成像后，用无药物胚胎介质代替含有药物的胚胎培养基。

 

TUNEL染色：在7 DPF时对幼虫脑冠状进行100μm切片，并进行TUNEL染色。

 

行为测试：所有的行为试验都是在室温（28°C）的一个区域进行的。行为测试包括记录24孔板中的幼虫。先前描述并实现了斑马鱼行为测试的视频采集系统。视频采集系统的参数设置为：检测阈值：20，小/大运动阈值：2，小运动阈值：0.2。在1 DPF CA后评价了斑马鱼幼虫的自发的游泳行为，.每孔24孔板充满了1毫升的水和每孔放入一个胚胎幼虫。经过30分钟的驯化，记录一小时的运动性能和测量总距离。

 

结果：心脏骤停导致斑马鱼脑内钙离子爆发：CA后体内神经元活性变化的研究，我们使用TG（HUC：gcamp5）转基因斑马鱼，其中细胞内Ca2+动态变化表明神经元的活动，记录神经元活动的实时变化。用机械加压心脏建立斑马鱼CA模型，用微电极泵直至停止。用活体时移聚焦成像研究CA时神经元活动。几乎所有的斑马鱼在按压后1分钟内停止心脏泵血。我们发现斑马鱼的大脑在CA.之后出现了一个钙离子爆发波。Ca2+波在后脑首先发起，然后依次传递到中脑和前脑。与对照组相比，57.7%（15/26）CA斑马鱼脑显示钙离子波，钙钙生成的潜伏期约为1801±291.2 s。神经元在钙离子波的传播过程中显示钙超载。总之，这些结果表明钙离子在ca后的增殖可导致神经元死亡。

 

咪达唑仑或氯胺酮预处理抑制心脏停搏诱导的钙波：以前的研究已经表明，兴奋性神经元死亡发生于脑缺血。为了研究钙诱导的钙离子通道是否与神经元死亡有关，我们研究了钙诱导的钙波是否能通过全身麻醉药来阻止。在建立CA模型前，用咪唑安定（0.5 mM）或氯胺酮（2.5 mM）对CA斑马鱼进行5分钟的预处理。与CA斑马鱼相比，咪达唑仑或氯胺酮预处理对钙诱导的钙离子生成有明显的抑制作用，提示麻醉药能抑制钙诱导的钙离子波。

 

抑制钙波生成降低心脏骤停后神经元凋亡: 神经元死亡是后CA综合征最严重的并发症。在本研究中，我们发现CA斑马鱼的神经元死亡比对照斑马鱼的TUNEL染色增加了。为了进一步研究钙离子是否参与了斑马鱼神经细胞凋亡，我们通过咪唑安定或氯胺酮预处理抑制钙诱导的钙离子波。结果表明，咪达唑仑（0.5 mM）或氯胺酮（2.5 mM）预处理能显著降低CA斑马鱼神经细胞凋亡。总之，这些结果进一步表明钙离子在ca后的增殖可能导致神经元凋亡，而咪达唑仑或氯胺酮预处理有可能减轻CA.神经细胞凋亡。

 

抑制钙离子波改善生存和运动功能：进一步探讨抑制钙诱导的钙离子通道是否能改善CA斑马鱼的存活率和神经功能，我们首先检查CA后1到5天的成活率。与对照组相比，CA斑马鱼的存活率明显降低。然而，与CA斑马鱼相比，咪达唑仑或氯胺酮预处理能显著提高存活率。运动功能是评价斑马鱼神经功能的一个关键因素。为了确定抑制钙离子通道是否能改善CA斑马鱼的运动，我们通过行为测试研究了自发运动功能。我们的研究结果表明，CA斑马鱼的运动距离显著低于对照斑马鱼，而咪达唑仑的预处理显著增加了运动距离。而氯胺酮预处理与CA斑马鱼的运动距离无明显差异。总之，这些结果表明，全身麻醉药预处理可提高存活率。咪达唑仑预处理明显减轻CA.术后神经功能缺损。