摘要：斑马鱼在结核病动物模型中占有一席之地。它的自然菌，分枝杆菌同人类病原体结核分枝杆菌共享主要毒力因子。成年斑马鱼，具有重组激活适应性免疫，它可以在结构化引起急性感染或慢性进展性疾病，以遏制分枝杆菌、干酪性肉芽肿。此外，最近研制出一种与人类潜伏感染密切相关的低剂量模型。这些模型是在光学透明的斑马鱼胚胎和幼虫上建立依靠先天免疫允许发展的肉芽肿，其他动物模型早期是无法应用的。通过显微注射或静脉注射结核分枝杆菌到不同的组织中，可诱导全身和局部感染有助于研究早期发病机制的某些方面，如吞噬细胞的招募，肉芽肿的扩展和维护，血管肉芽肿和吞噬细胞介导的传播结核分枝杆菌。这为分枝杆菌驱动的促进肉芽肿形成的机制提供了新的见解，炎症的双重作用，巨噬细胞死亡机制为疾病进展以及自噬的宿主保护作用提供了新的见解。因此，斑马鱼模型现在越来越多地用于探索用宿主药物辅助治疗结核病。

 

 

简介：结核分枝杆菌（MTB）是最成功的人类病原体之一，估计感染了三分之一的人口，并在2013中导致了九百万个新的结核病病例。结核分枝杆菌寄生在巨噬细胞和可以在人类宿主体内潜伏感染持续几十年。肉芽肿的形成是结核病的病理中心。结核肉芽肿是高度组织化的宿主细胞结构含有受感染的巨噬细胞和坏死细胞碎片内芯。在周围的细胞层，包括树突细胞、中性粒细胞和T细胞和B细胞在内的其他免疫细胞与肉芽肿内的细菌隔离。潜伏的肉芽肿许多年后仍有感染激活的能力，当肉芽肿完整性丧失时可传播该疾病。抗生素耐药性的惊人增长和缺乏有效的预防潜伏或重新激活结核病的疫苗，强调需要新的治疗策略来控制结核病。动物模型对于研究结核病理学中的宿主和细菌因素以及评价新药和候选疫苗是必不可少的。从实验性MTB感染小鼠、豚鼠、兔子和非人灵长类动物，特别是猕猴，可以推断出人类结核病病理学的重要见解。此外，目前已有10多年的时间，斑马鱼已被广泛用作结核病的替代动物模型。斑马鱼可以感染海鱼分枝杆菌（Mm），冷血脊椎动物的天然病原体。MTB和Mm分享3000个同源基因，平均氨基酸同源性为85%。Mm偶尔会引起人类肉芽肿性皮肤感染，被称为“鱼缸肉芽肿”。 在斑马鱼中，Mm引起肉芽肿与人类肺结核肉芽肿细菌遏制系统性疾病有强烈的结构的相似性。虽然结核分枝杆菌和Mm对不同宿主的适应性差异不容忽视，但结核分枝杆菌的重要毒力因子在功能上能够补充Mm基因的突变，反之亦然。肉芽肿一直被认为是一种静态的宿主防御结构。然而，肉芽肿的形成是由细菌毒力的驱动，肉芽肿是高度动态的结构，特别是在发病的早期阶段，能促进分枝杆菌的传播. 斑马鱼的研究表明巨噬细胞的存在足以引起肉芽肿的形成。这意味着在透明的斑马鱼胚胎和具有功能性先天免疫系统的幼虫身上可以观察到肉芽肿形成的早期阶段，但尚未产生适应性免疫。

 

成年斑马鱼结核病: 在自然环境中，经胃肠道进入是Mm感染的最有可能主要途径，而成人斑马鱼的实验感染通常是通过腹腔注射来实现的。感染取决于特定剂量和应变，表现为急性症状或发展为慢性进行性疾病。急性疾病以快速致死性炎症为特征，更常见于人源分离的Mm，形成独特的基因簇。腹部肿胀、出血、皮肤溃疡通常在慢性进展性疾病的终末阶段观察. 这与免疫应答基因和炎症标记物在转录水平上的强烈诱导有关。在外在症状变得明显之前，肉芽肿在不同的器官，包括肝脏，胰腺，肾，肠，脾，有时也在结缔组织形成。一些腹腔感染斑马鱼也发展与脑组织和脑膜关系密切的肉芽肿；因此，该模型也可以用来研究结核性脑膜炎。成年斑马鱼肉芽肿由围绕中心区域的上皮细胞组成。巨噬细胞是主要的细胞类型，分枝杆菌可通过抗酸染色检测。斑马鱼多数肉芽肿显示中央核坏死，多为缺氧。中央坏死是人类结核肉芽肿的一个显著特征，在小鼠体内很难复制，只能在一些较新的结核小鼠模型中模仿。此外，成熟的肉芽肿在斑马鱼通常是多中心，被纤维囊包围。钙化肉芽肿尚未在斑马鱼上观察到，他们的肉芽肿比人类结含有更少的淋巴细胞。尽管淋巴细胞数量较低，适应性免疫功能对控制斑马鱼结核病至关重要。慢性进行性感染斑马鱼模型已被证明是有用的抗结核药物筛选以及对宿主靶向药物的测试。通过药理抑制血管内皮生长因子（VEGF）信号降低整体感染负担，减少斑马鱼肉芽肿血管。结合对结核分枝杆菌感染兔的研究，揭示抗血管生成药物联合抗结核药物在治疗肺结核中的潜在应用。由于动物模型的局限性，结核潜伏期和再激活机制的研究受到阻碍。最近，已经证明斑马鱼Mm模型可以用来模拟潜伏疾病的各个方面。低剂量Mm腹腔注射几周后，斑马鱼建立稳定的细菌负荷和肉芽肿的常数。复苏促进因子体外激活显示了Mm的休眠。潜伏期的发展依赖于rag1介导的适应性免疫，免疫抑制诱导γ-射线辐照导致休眠的细菌种群恢复。该模型对新药和候选疫苗的临床前试验有很大的潜力。为证明原理，BCG疫苗和不同分枝杆菌抗原的DNA疫苗可以保护斑马鱼免受MM感染。斑马鱼是不容易自交的，因此，在这个模型的研究中经常观察到大的变异。然而，斑马鱼种群的自然异质性被利用来了解与个体控制潜伏感染的能力相关的遗传差异，或者说，这些因素与激活的危险因素有关。这项研究表明，控制良好感染的斑马鱼个体不仅显示出有效的Th1免疫反应，而且还具有足够的Th2反应。

 

斑马鱼胚胎和幼虫中的结核病: 斑马鱼卵的体外受精能很容易地获得发育中的胚胎。受精后2天胚胎自然孵化（DPF），但1 DPF后绒毛膜可以去除便于实验感染。受精后72小时，胚胎能发育为幼虫，受精后5 DPF的幼虫成为能独立进食。在这个发育时期，主要的功能免疫细胞类型是巨噬细胞和中性粒细胞；因此，免疫依赖于先天免疫。胚胎和幼虫在甲烷磺酸三卡因（MS222）麻醉状态下发育正常. 越来越多的荧光有助于可视化不同的免疫细胞类型、亚细胞结构和激活免疫应答基因。斑马鱼胚胎使用吗啉反义寡核苷酸基因敲除研究有力地促成了早期的结核分枝杆菌的发病机制的认识。随机突变筛选证明是结核病研究中斑马鱼突变体的有用来源。基因打靶技术的最新进展将导致在胚胎/幼虫和成人结核病模型中使用更多的基因敲除。这也将使细胞或组织特异性的基因中断，这一直是斑马鱼模型的局限性。斑马鱼胚胎和幼虫特别适合用于抗结核药物的筛选，这些药物可以简单地添加到培养基中。然而，并非所有的化合物都通过皮肤有效地摄取，因此，该系统中的药物功效应与吸收特性相关联，以消除假阴性，并能更好地与哺乳动物模型中的试验相比较。全身或局部的胚胎和幼虫的感染可以通过不在部位注射细菌实现，每一个都有独特的优势，以解决不同的研究问题。

 

静脉感染：在首次对胚胎肺结核模型的描述中，通过静脉途径进行全身性感染是迄今为止最常用的方法。静脉感染的机会是在26 HPF血液循环开始后不久，但对血管系统的显微注射也可以在后期进行。Mm细菌送入血主要是通过巨噬细胞吞噬。这是一个快速的过程，在30 - 60分钟内内化约200 CFU。感染后3天，感染和未感染的巨噬细胞可见于幼虫组织上密集的肉芽肿样聚集体，但大多发生在尾部腹侧血管附近，在临时造血部位，称为尾部造血组织。大多数静脉感染的胚胎也会在大脑的不同区域形成聚集物，而当细菌注射时，这种情况仍会发生。电子显微镜观察表明，一些被感染的巨噬细胞在幼虫肉芽肿状聚集体显示上皮样细胞形态和多核巨细胞，其鲜明的特点是成熟的肉芽肿。此外，由于这些聚集体中的Mm细菌表达了肉芽肿特有的荧光报告基因，微环境似乎是类似的。这些幼虫肉芽肿的环境已被证明有利于快速发展和多耐药细胞内Mm群体传播。细菌外排泵抑制剂如维拉帕米可以降低这种耐受性，表明该系统可用于研究耐受机制和克服耐受的治疗方法。用标记的Mm菌株可以容易地从荧光图像中评估肉芽肿数目、个别肉芽肿大小和细菌总负担。

 

卵黄感染：在16～128细胞期的胚胎中注入Mm，导致感染最初局限于巨噬细胞未进入的区域，但通过一个未知机制扩散到幼虫组织中。一旦感染扩散，细菌是由巨噬细胞和肉芽肿摄入类似于静脉感染模型。蛋黄注射法可用于药物筛选，因为它可以使用机器人注射器进行自动化。以卵黄作为注射部位，结果表明，不仅mm，而且MTB细菌能扩散到幼虫组织内并在巨噬细胞内存活。斑马鱼通常饲养在28°C，但饲养温度上升到34°C，以支持结核分枝杆菌的生长。然而，由于结核分枝杆菌生长缓慢，在斑马鱼幼虫中没有观察到由感染巨噬细胞形成的肉芽肿样聚集体。

 

后脑脑室感染：注射细菌或趋化蛋白和脂类后，后脑脑室腔内充满脑脊液，巨噬细胞可以招募进入。这是一个方便的注射位点来研究趋化性或促进MM传播的宿主和细菌因素。而大量的细菌在后脑局部发展，巨噬细胞可以从脑室流出，并在头部、躯干或尾部区域携带Mm到远端位置。后脑注射也被用来比较不同菌株的建立在接受低剂量接种1–3Mm胚胎感染细菌的能力，可能类似于人类感染结核分枝杆菌的自然感染剂量。

 

耳囊感染: 在发育中的耳朵腔注射细菌是另一种可能性，可以产生局部感染，这有助于研究白细胞在远端部位的巨噬细胞和中性粒细胞的招募和动员。

 

皮下感染：当Mm被注入充满液体的腔内时，如血液或后脑室，主要是由巨噬细胞引起的吞噬功能。然而，中性粒细胞在其他结核杆菌感染和结核感染中起重要作用。中性粒细胞需要一个表面进行有效的吞噬作用，并且当斑马鱼皮下注射时，它能吸收细菌。因此，皮下注射或注射其他组织如肌肉或尾鳍有助于解决中性粒细胞对分枝杆菌病早期发病机制的贡献。

 

尾鳍感染：幼虫尾鳍由两个上皮细胞层组成，中间有间充质细胞、细胞外基质和胶原纤维。注射到尾鳍的Mm会被巨噬细胞和嗜中性粒细胞迅速吸引，形成单个肉芽肿性病变。这种方法使从第一个感染细胞到坏死中心形成阶段的肉芽肿发展过程可视化。坏死的中心最终从尾鳍的薄组织中挤出，形成中央孔。这薄薄的组织非常适合高分辨率显微成像。

 

发病早期巨噬细胞和中性粒细胞的发病机制：巨噬细胞在胚胎发育过程中的遗传耗竭表明巨噬细胞限制了Mm的生长，但对于Mm向组织的扩散是必不可少的。有几个因素参与了斑马鱼体内巨噬细胞感染的控制，包括肿瘤坏死因子（TNF）、自噬组件（p62/SQSTM1和BAX），和巨噬细胞特异性穿孔素（MPEG1）。相比之下，Mm细菌似乎能够逃避活性氧或氮介导的防御。

 

炎症的保护和病理作用：炎症反应在结核病发病机制中的双重作用在最近的评论中得到了广泛的讨论。与其他动物模型的许多研究相一致，斑马鱼幼虫被发现无论有无炎症反应都对Mm感染高度敏感。斑马鱼幼虫的光学透明性有助于区分是否影响肉芽肿或维护早期形成的缺陷在炎症反应中的作用。斑马鱼的TNF受体敲除加速形成肉芽肿而导致肉芽肿和Mm细胞外快速生长。有限的TNF产生导致相同的表型, 支持TNF是肉芽肿形成的可有可无，但对于维持肉芽肿完整性至关重要。斑马鱼突变筛选揭示在Mm感染过程中炎症细胞因子和脂质介质之间的错综复杂的。

 

自噬的保护作用：对自噬的认识始于对细胞内病原体的宿主防御机制的研究。通过营养饥饿或雷帕霉素治疗刺激细胞自噬可以克服MTB诱导溶酶体成熟障碍。结核分枝杆菌或BCG感染细胞中的一些siRNA和化学屏障已将自噬作为治疗结核病的治疗靶点。在自噬过程中，蛋白质聚集体，细胞器或细胞内的细菌成为封闭在由双膜和标志蛋白LC3的自噬体。通过受体介导途径选择性自噬要求分枝杆菌逃避吞噬体或诱导到吞噬体膜允许他们被泛素化损伤。一个功能ESX-1分泌系统对分枝杆菌的吞噬体和泛素化的破裂是所需的。

 

结论：结核病研究斑马鱼模型的主要优点是在胚胎和幼虫的光学通路，幼虫对肉芽肿先天免疫的背景下研究其早期阶段。胚胎和幼虫的遗传和药理学操作的便利性有助于更好地了解巨噬细胞和中性粒细胞在早期发病机制中的作用，并揭示了分枝杆菌利用的分子机制，以促进它们在受感染宿主体内的扩增和传播。可以预见，斑马鱼胚胎和幼虫也将有助于对先天免疫的表观遗传学机制进行体内研究，这是最近在免疫学中出现的一个新概念。先天免疫与BCG疫苗对非结核分枝杆菌疾病和癌症的非特异性保护作用有关，也可能在结核病中发挥重要作用。自噬是另一种新的免疫学模式，是防御分枝杆菌的关键，也与训练有素的先天免疫有关。斑马鱼幼虫的分枝杆菌的自噬反应体内可视化支持体外研究表明自噬在宿主防御的核心作用。尽管在免疫试剂和适应性免疫系统特性方面有局限性，成年斑马鱼也是结核病研究的有益补充物，特别是因为鱼和人类肺结核肉芽肿的结构的相似性。斑马鱼模型现在越来越多地应用于宿主导向治疗结核病的转化研究。从这项工作中发现的潜在药物靶点包括巨噬细胞迁移、炎症、细胞死亡调节、缺氧信号转导、血管生成和mTOR独立自噬。靶向宿主避免了对细菌的直接选择，因此降低了耐药性发展的风险。鉴于上述许多有用的特性，斑马鱼可以在评估发育毒性和体内药物作用机制方面发挥重要作用。

 

https://link.springer.com/article/10.1007/s00281-015-0522-4