摘要：最近的体外研究表明，软珊瑚提取物（SCDE）具有较强的抗炎活性。对动物模型的抗炎作用仍有待确定。本研究使用多脂糖刺激斑马鱼评估SCDE的体内抗炎作用。还调查SCDE对斑马鱼是否有毒性作用。当暴露于100ug/ml的SCDE时，斑马鱼胚胎的存活率、心搏率、发育异常无明显变化。当暴露于200ug/ml、400ug/ml的SCDE时，出现致命毒性。用LPS处理斑马鱼模型可显著提高活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的生成。而SCDE抑制LPS诱导产生的ROS和NO，并呈剂量依赖性。这些结果表明，SCDE通过抑制ROS和NO的生成，减轻LPS诱导的炎症。此外，SCDE对暴露于LPS的斑马鱼胚胎的细胞损伤有保护作用。这个结果可以解释SCDE体外和体内的抗炎作用，这表明其可能是一个强大的抗炎剂。

 

 

背景：许多海洋生物具有陆地生物没有的独特结构。软珊瑚是一群无脊椎动物，它们形成了一组广泛分布于世界各地珊瑚礁中的海洋生物。脊椎动物斑马鱼是一个小型的热带淡水鱼，它已经成为一个有用的脊椎动物模式生物，由于其体积小、透明、低成本维护、形态和生理类似哺乳动物。由于这些优点，最近，斑马鱼作为一种模型生物在体内药物毒性和药效研究中的价值得到了认可。此外，斑马鱼胚胎的光学透明性使体内的非侵入性和动态成像成为可能。因此，斑马鱼是一种非常有用的动物模型，用于各种炎症研究。在体内抗炎试验中，斑马鱼被广泛认为是有效的抗炎试验方法。因此，本研究的目的是评估SCDE的发育毒性，并研究其在斑马鱼模型体内的抗炎作用。

 

方法：软珊瑚提取物的制备：软珊瑚来自济州岛，由济州生物多样性研究所鉴定。用70%乙醇喷雾杀灭表面附着的微生物后，用自来水冲洗样品，去除表面附着物和碎片。然后将样品冻干并磨成粉末。每20g样品分别用2L, 70%的乙醇在25℃下提取24小时。每个样品进行三次萃取。最后，过滤的浓缩液在真空下用旋转蒸发器浓缩。

 

亲代斑马鱼的起源与维持：从经销商处购买10条斑马鱼，饲养在28.5°C，明暗14:10h环境中。斑马鱼一天喂三次，6天/周，片状食品辅以活盐水虾。从自然产卵中获得胚胎。在培养皿中30分钟内完成胚胎的采集。

 

胚胎毒性测定：受精后7-9h,斑马鱼胚胎随机分布到12孔板中，每孔10个胚胎，每孔含2毫升胚胎培养液。胚胎与不同浓度1, 10, 100、200和400ug/ml的浓SCDE孵育72 h。最终DMSO浓度为0.1%，在检测过程中，使用0.1%的DMSO作赋形对照剂。在整个实验过程中没有更新培养基。在整个实验过程中每天监测存活率。每天取出死胚胎直至受精后72h。受精后48h,胚胎用0.4%三卡因麻醉，测定心脏毒性。用显微镜测量心脏跳动速度超过3分钟，结果以每分钟心脏跳动率表示。在受精后72h用吖啶橙染色检测细胞死亡。斑马鱼胚胎暴露于SCDE24和48h后对其进行致畸试验。显微镜下观察非致死性畸形。所有试验都有三份平行试验。

 

脂多糖（LPS）刺激斑马鱼胚胎细胞死亡及细胞内活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的生成：在12孔板上，用移液器收集斑马鱼胚胎并排列。每孔含有2ml胚胎培养液和15个受精7-9h的斑马鱼胚胎。然后胚胎同有或无SCDE孵育1h . 为了诱导炎症反应，将胚胎暴露在10μg／ml的LPS中，溶解于胚胎培养液中，28.5°C ，24小时。此后，斑马鱼胚胎被转移到新鲜的胚胎溶液中，在那里发育72h。根据先前报道的方法，估计斑马鱼胚胎细胞死亡和细胞内ROS和NO生成。用吖啶橙染色法检测活胚细胞死亡。吖啶橙染色细胞有干扰质膜透性，故优先染色坏死或非常晚期凋亡细胞。将斑马鱼胚胎移植到24孔板中，用吖啶橙溶液（7μg／ml）处理，在28.5°C的条件下，在黑暗中孵育30分钟。孵育后，用新鲜胚胎培养液冲洗胚胎。观察前麻醉，荧光显微镜下观察，它配备有一个coolsnap Pro彩色数码相机。对染色胚胎的图像进行细胞死亡分析，单个胚胎的荧光强度使用ImageJ软件量化。通过比较处理胚胎与对照组的荧光强度来计算细胞死亡。用氧化敏感荧光探针染料DCF-DA分析斑马鱼胚胎中活性氧的产生，斑马鱼胚胎被转移到24孔板中，DCF-DA（20μg／ml）溶液处理，板在黑暗中28.5°C孵育1小时. 孵育后，用新鲜胚胎培养液冲洗胚胎。观察前麻醉，荧光显微镜下观察，单个胚胎的荧光强度使用ImageJ软件量化。通过比较处理胚胎与对照组的荧光强度来计算ROS的产生。用荧光探针染料DAM-FM -DA分析斑马鱼胚胎中活性氧的产生，斑马鱼胚胎被转移到24孔板中,DAF-FM DA（5μM）溶液处理,在28.5°C.黑暗环境中孵育1 h。孵育后，用新鲜胚胎培养液冲洗胚胎。观察前麻醉，荧光显微镜下观察。通过比较处理胚胎与对照组的荧光强度来计算NO的产生。

 

结果：SCDE对斑马鱼胚胎生存率，心率、形态变化和细胞死亡的影响：为了确定SCDE毒性，在这个研究中，我们观察到斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的SCDE后生存率，心脏跳动率和形态学变化。1, 10、100μg/ml不能明显导致斑马鱼胚胎死亡。在受精后24h，胚胎暴露于200和400μg/ml的SCDE能引起死亡。特别是，400μg/ml的SCDE造成约90%胚胎死亡率。由于毒性太高，我们没有对斑马鱼胚胎进行200和400μg/ml SCDE的进一步分析。在心率试验中，心跳率与对照组相比无显著变化，表明在试验浓度下无心跳毒性。在受精后24和48h时，斑马鱼胚胎暴露于SCDE中，检查其引起的超形态缺陷。斑马鱼胚胎未见形态学异常，这表明SCDE对斑马鱼胚胎发育没有毒性效应。评价SCDE是否对细胞具有毒性作用，对斑马鱼胚胎进行72小时处理，细胞死亡是通过吖啶橙染色法测定。斑马鱼胚胎在试验浓度下未见SCDE的细胞毒作用。随着初步研究的结果，我们选择了SCDE浓度为25, 50、100μg/ml做进一步实验。

 

SCDE对LPS诱导的ROS的体内效应：在斑马鱼胚胎使用氧化敏感的荧光探针染料DCF-DA我们研究了LPS诱导的ROS的产生。图显示出SCDE对LPS诱导的ROS的产生具备保护作用。对照，不含LPS或SCDE，产生清晰的图像，而仅给予LPS，产生的荧光图像，这表明在LPS存在时斑马鱼胚胎产生ROS。当斑马鱼胚胎在LPS使用前进行SCDE处理，观察到ROS剂量依赖性减少。

 

SCDE对LPS诱导的NO的体内效应：用LPS刺激斑马鱼胚胎可提高NO产量。然而，斑马鱼胚胎SCDE预处理以剂量依赖的方式降低NO产生。

 

SCDE对LPS诱导的细胞死亡体内保护作用：与未经LPS处理的斑马鱼胚胎相比，LPS处理斑马鱼胚胎细胞死亡显著升高。然而，LPS诱导的SCDE处理的斑马鱼胚胎细胞死亡呈显著的剂量依赖性降低。

 

结论：总之，SCDE对动物模型的抗炎活性的直接影响仍有待确定。因此，在本研究中，我们研究了SCDE对LPS诱导的活体斑马鱼模型炎症的抗炎作用。正如预期的那样，SCDE表现出很强的抗发炎的特性对抗LPS诱导的炎症。SCDE对斑马鱼胚胎没有毒性效应。SCDE在体外和体内表现出抗炎作用，这表明其可能是一个强大的抗炎剂。此外，还需要进一步的研究来探索SCDE的主要成分。https://link.springer.com/article/10.1186/s41240-017-0077-5