摘要：目前的研究已经证实甘丙肽受体激动剂对斑马鱼的血糖水平的影响。从受精后第二天到成年，呈现一个非常丰富的甘丙肽能神经支配内分泌胰腺发育过程。纤维起源于组成的甘丙肽-IR神经节，非肾上腺素能（无感觉）位于胰腺组织的吻侧。神经节位于肠前段的起始侧，靠近迷走神经的肠支。甘丙肽IR神经元没有显示酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶和囊泡乙酰胆碱转运体应用抗体的免疫反应性。腹腔注射甘丙肽模拟NaX 5055导致血糖水平显著增加。注射另一种甘丙肽受体激动剂，galnon，也引起血糖上升；但无统计学意义。目前的研究结果表明，在哺乳动物中，在斑马鱼甘丙肽参与血糖水平的调节。然而，需要进一步的研究来阐明甘丙肽的确切作用机制。

 

 

简介：甘丙肽是一个29到30个氨基酸的神经肽，在中枢和外周神经系统广泛表达。它是表达的几个经典小分子神经递质的神经元，通过减少其释放对突触传递起抑制作用。首次报道甘丙肽生物活性对犬和大鼠血糖水平的影响。免疫组织化学研究表明，甘丙肽阳性神经纤维在胰腺中出现在几个物种，包括人类、大鼠、小鼠、狗、猫、猪、反刍动物、鸡、蜥蜴、蛙、鱼。狗已被证明通过甘丙肽释放胰岛素的抑制剂，这种作用是由胃肠道蛋白介导的。然而，甘丙肽在胰腺内分泌功能尚未完全阐明。甘丙肽对血糖水平的调节作用和甘丙肽神经支配内分泌胰腺有物种差异。人体静脉注射甘丙肽不影响葡萄糖刺激的胰岛素分泌，虽然甘丙肽抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此外，甘丙肽能神经支配胰腺的狗和老鼠是很多的，但大鼠是非常罕见的。一些研究表明，甘丙肽在胰岛是交感神经递质。然而，对于葡萄糖稳态而言，这种肽的其他来源不能被排除在外。胰岛富含自主神经。纤维通常沿着血管，穿入胰岛，终止于内分泌细胞。，哺乳动物肾上腺素/交感轴突支配胰岛是节后大部分神经细胞体位于腹腔神经节或椎旁交感神经节。斑马鱼已成为脊椎动物生物学研究的一个很好的模式生物，特别是脊椎动物遗传学和胚胎发育。它也是人类疾病的潜在模型。斑马鱼有许多人类疾病模型，包括遗传性疾病和后天性疾病，包括糖尿病。斑马鱼有许多特征，使它们成为有吸引力的研究工具。一个基本的优点是它们与人类有相当多的遗传特性，而且它们的一些器官系统与哺乳动物中发现的非常相似。此外，斑马鱼胰腺与人类胰腺的形态和生理相似。许多实验室利用斑马鱼来研究影响人类器官的病理过程。在发育过程中，哺乳动物胰岛的广泛神经支配表明，神经可以调节胰岛的发育和成熟，并可能是支持这些过程的外在因素的来源。甘丙肽，除了经典神经递质的作用，还具有其它功能。有证据表明，它在个体发育过程中起着营养因子的作用。然而，在该领域的文献中没有对斑马鱼胰腺自主神经支配或甘丙肽对其内分泌部功能的潜在影响的信息。因此，本研究的目的是探讨内分泌胰腺包括甘丙肽素能神经支配和甘丙肽受体激动剂对斑马鱼的血糖水平的影响。

 

材料和方法：动物：使用野生型Tubingen和Tg斑马鱼。转基因TG斑马鱼（mnx1：TagRFP）被用来定位β细胞。Mnx1基因被发现在运动神经元与胰腺中的表达。在斑马鱼胰腺，Mnx1完全是在β细胞表达。成年斑马鱼饲养在28.5°C， 14:10-h光–暗的光照循环环境下。胚胎是通过自然交配获得的。它们保存在28.5°C。

 

斑马鱼甘丙肽探针的合成：含有甘丙肽基因pGEM-T-easy载体线性化。使用SP6和T7 RNA聚合酶合成DIG标记的反义RNA探针，分别使用地高辛RNA标记试剂盒。地高辛标记探针纯化，定量，并检查完整性。

 

原位杂交：胚胎被固定在4%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH值7.4，一系列磷酸盐缓冲生理盐水+ 0.1%吐温20–甲醇溶液（3:1、1:1、1:3）在室温脱水各10分钟，最后存储在100%甲醇在−20°C过夜。经一系列PBSTw–甲醇溶液（1:3、1:1、3:1）水化，被蛋白酶K消化。70°C用探针进行预杂交和随后的杂交过夜。杂交后，胚胎在一系列的如下处理：50%洗甲酰胺，5×SSC，0.1%吐温20（HYB−）- 2×0.15 M NaCl，0.015 M柠檬酸钠、0.1%吐温20（SSCT）溶液（3:1、1:1、1:3），2×SSCT和0.2×SSCT在70°C各处理 15分钟。再进行下一步处理：0.2×SSCT–PBSTw（3:1、1:1、1:3），PBSTw和封闭液封闭3h，然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体封闭液（1:2000稀释）在4°C孵育.过夜。标本用PBSTw洗涤三次，然后在碱性磷酸酶缓冲液(100 mM Tris, pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween 20).中冲洗。胚胎在HNPP /快红TR碱性磷酸酶缓冲液中染色。显色反应通过PBSTw洗两次终止，然后固定在4%的PFA磷酸盐溶液，pH值7.4。用LSM 700共聚焦激光扫描显微镜对胚胎进行分析。

 

免疫组织化学：在4°C时，用4% PFA O／N固定，胚胎和幼虫全部被固定。斑马鱼在固定前打开腹腔，解剖内脏。内脏冷冻保存在蔗糖溶液中（20%，0.1M PB）在4℃保存24 - 48小时，然后冷冻和包埋。然后切片。标本冲洗，并同0.3% Triton X-100（pBS-T，pH 7.4），1%的二甲基亚砜（DMSO），0.1%叠氮钠，和4%山羊血清（NGS）的PBS溶液预孵育4–6h。然后将标本与初级抗体孵育14–24小时。对切片彻底冲洗，然后同二抗（1:1000）在4°C孵育 12–24 h。用PBS清洗、含50%甘油的PBS冲洗，标本固定在80%甘油-PBS中。用LSM 700共聚焦激光扫描显微镜检查。用MATLAB 2009软件编译了一组图像，以产生最大强度的投影图像。对抗血清特异性进行了仔细的对照研究。阴性对照是在染色程序中省略所有初级或次级抗体。所有类型的对照导致完全消除免疫染色。

 

腹腔注射：为进行功能性实验，采用成年鱼类（12个月龄，雄性和雌性）。在注射前，将鱼禁食72小时。体重（g）是通过把动物放进一个小的烧杯中，然后减去非鱼的重量来测量的。腹腔注射麻醉鱼，将其放入28.5°C，含0.02% MS-222水中。当动物深度麻醉时，将其放置在一个外科手术台上。海绵被切成两半，一个做出一个浅槽。在注射过程中，槽被用来固定鱼。带鱼的手术台立即被转移到邻近的解剖显微镜下注射。注射用10uL注射器进行。针通过中线进入腹后部。注射部位靠近腹鳍，而不是肛门。针向上减少造成内脏损伤的可能性。在第一组（n = 10）鱼被注射15µg／g型5055，(甘丙肽肽类似物和非选择性甘丙肽受体激动剂、0.5mg/g葡萄糖溶于Cortland盐溶液，pH值为7.45.).第二组，鱼注射5ug/g galnon，一种非肽，非选择性甘丙肽受体激动剂和0.5毫克/克葡萄糖。对照组鱼（N = 10）注射0.5µg／g葡萄糖。

 

全血糖测定：注射后2.5小时鱼用0.02% MS-222三卡因麻醉，用剪刀把鱼尾剪去从尾部动脉收集全血。然后将动物断头处死。对全血进行分析。

 

结果：成年斑马鱼从受精后第二天，在斑马鱼各发育阶段免疫荧光染色显示一个非常密集的甘丙肽-IR神经纤维支配的内分泌胰腺。在幼虫和幼鱼显示纤维起源于神经元位于延髓的胰腺组织。甘丙肽能神经元大多聚集在两神经节双侧矢状面。剩下的甘丙肽IR神经元分布甘丙肽负神经细胞体形成大神经节扩散。神经节位于肠前段的起始侧，靠近迷走神经的肠支。甘丙肽IR神经元通常形成沿迷走神经分布的单细胞条。甘丙肽阳性神经元胞体和单小簇沿迷走神经分支分布，特别是在分支点。成年鱼，甘丙肽IR神经节以类似的方式分布靠近肠前段，在胰腺组织外面。腹腔注射甘丙肽模拟NaX 5055导致血糖水平显著增加。另一种甘丙肽受体激动剂，galnon，也导致血液中的葡萄糖水平的提高；然而，它没有统计学意义。