摘要：斑马鱼胚胎正在成为药理学和毒理学研究的模型。我们利用斑马鱼胚胎研究八种甲基黄嘌呤的心血管效应和一般毒性：氨茶碱、咖啡因、二羟丙茶碱、多索茶碱、乙羟茶碱、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、己酮可可碱和茶碱。

 

方法：八种甲基黄嘌呤对1-2细胞期斑马鱼胚胎进行显微注射，在不同的时间点对一般毒性和心血管的影响进行了分析。评估胚胎毒性和致畸性，了解这些化合物的毒性。心脏的结构和功能改变被用来评估心血管效应。

 

结果：研究结果表明甲基黄嘌呤药物不同的活动模式。咖啡因，IBMX，己酮可可碱和茶碱具有胚胎毒性和致畸；氨茶碱、多索茶碱、乙羟茶碱仅在高剂量出现胚胎毒性和致畸性。二羟丙茶碱出现极小（＜10%）的胚胎毒性和致畸性。大多数这些药物在最大剂量时引起20-40%注射胚胎的心脏结构改变。这种结构上的改动是致命的胚胎最终死于120小时内。所有的药物在48小时可引起心率短暂升高，在96小时恢复到基线水平。对斑马鱼的功能效应类似于人类和其他脊椎动物。

 

结论：我们的研究结果表明，潜在的毒性和致畸性的不同会在胚胎发育过程中，生命中最敏感的时期。尽管在作出任何结论之前需要考虑种间差异。我们的研究表明，在治疗范围内的甲基黄嘌呤的单一暴露除了会导致胚胎毒性和致畸性，可引起心功能障碍。相比其他的甲基黄嘌呤茶碱的似乎是安全的，胚胎的致畸作用和心脏毒性的程度较低。

 

 

背景：甲基黄嘌呤是一种世界范围内广泛使用的物质。甲基黄嘌呤的来源包括茶，咖啡，巧克力，能量饮料和药物。他们可以是自然发生的，如咖啡因、可可碱和茶碱，或人工合成的衍生物，如茶碱和可可碱。饮料含有丰富的甲基黄嘌呤。这些物质还用于治疗各种疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、周围血管疾病、肥胖、高脂血症和早产儿呼吸暂停。因此，这些化合物通常通过各种饮料和药物每日摄取。这些药物具有类似的作用机制，它们通过抑制磷酸二酯酶、腺苷和GABAA受体拮抗作用以及阻断钙通道发挥作用。人类接触甲基黄嘌呤，最早出现在妊娠期并持续整个生命过程。心脏毒性和血流动力学扰动是甲基黄嘌呤毒性两大方面。甲基黄嘌呤的毒性观察发现快速性心律失常包括窦性心动过速和室性期前收缩是最常见的心律失常。还可引起脉压、低血压、心肌缺血和梗死。心脏毒性的复杂性和相关性加强对甲基黄嘌呤诱导的心脏毒性的进一步研究。我们研究的目的是双重的。一方面，我们想研究一般毒性和心脏毒性。同时，我们也要研究这些药物的致畸作用。为了实现我们的目标，我们利用斑马鱼胚胎为我们提供关于这些药物的毒性和致畸性。斑马鱼作为一种预测动物模型，用于评估各种化合物和药物在体内的作用和毒性，许多研究表明哺乳动物和斑马鱼毒性之间有着惊人的相似性。此外，最近的证据也显示高度的斑马鱼和人类已知的药理反应之间的相似性。超过其他动物模型一般的优势。它们具有简单的心脏和血管系统，血管树发育的分子机制与高等脊椎动物相似，显示高度的解剖和功能保护。48 小时，斑马鱼心血管系统功能发育齐全，具有复杂的离子通道和代谢过程。像哺乳动物的心脏起搏器，控制心跳，血液由心房收集并通过心室泵入全身。斑马鱼胚胎的透明度使研究心率和节律、心脏形态和血液循环变得容易。转基因胚胎的有效性使人们更容易有效地研究心血管系统的体内效应。斑马鱼胚胎显微注射甲基黄嘌呤化合物预先确定的每种药物的五种剂量梯度进入斑马鱼胚胎1-2细胞细胞发育阶段。根据形态学缺陷，将存活/活胚的表型分为正常、轻度和重度。其次，我们研究会考虑到心脏的结构和功能方面的心脏毒性。

 

方法：药物：八种甲基黄嘌呤药物氨茶碱、咖啡因、二羟丙茶碱、多索茶碱、乙羟茶碱、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、己酮可可碱和茶碱。

 

斑马鱼的饲养和收集卵子：成年AB野生型和转基因斑马鱼TG，饲养在14:10 h光：暗周期，28 °C循环系统，pH值维持在7，电导率在400和500μS之间。每天用颗粒状食物混合喂养三次，上午和晚上用颗粒饲料，下午用卤虫饲喂。成年斑马鱼用于产卵。雄性和雌性分别在第二天和第二天早晨放入繁殖箱中，收集新鲜的胚胎。去除未受精卵、死胚或坏胚，选择1-2细胞期优质胚胎进行显微注射。

 

显微注射：斑马鱼胚胎注射1-2细胞期的五种不同浓度的八种甲基黄嘌呤。注射的总体积为5 nL /胚胎，每个浓度至少注入100个胚胎。每种化合物均以0.05%酚红作为示踪剂共注入。通过计算药物在纳克总量得到了药物注射胚胎数总量，每胚胎注射的药物剂量为0.25纳克至20纳克。二氯苯胺（DCA）作为阳性对照和胚胎注入0.05%红酚无菌水作为阴性对照。以未注射胚胎为对照，证实针刺本身对胚胎无任何影响。显微注射后，在培养皿中采集胚胎， 28℃保存在饲养水中，直至进一步评价。任何有缺陷或损坏的胚胎都被丢弃。

 

死亡率和一般形态学评价：24, 48和72小时每个时间点记录注射后的胚胎死亡率。对每个药物的生存率进行了计算和在72小时绘制剂量生存图。在48和72 h，从头部到尾部对其进行一个全面的评估。基于评估的异常，胚胎的表现型又分为正常、轻度或严重。

 

心血管效应评价：执行显微注射后，评估心脏结构缺陷和甲基黄嘌呤药物对心脏功能的影响。

心脏结构缺陷：48小时后，对任何结构性心脏异常的胚胎进行评估。分为两组：正常的表型，即胚胎没有明显的心脏异常，与具有心脏表型的胚胎，即具有明显结构心脏异常的胚胎。然后计算每种药物的心脏表型胚胎的百分比。此外，心脏表型胚胎被分为“3”，“2”和“1”。3，心室稍小的正常心脏形态；2，心房和心室要么压缩要么严重扩大、变形他们之间没有明确的边界,1，心房和心室的严重缺陷，变形和不明确。

心血管终点的评估：除了结构性心脏缺陷外，我们还评估了其他缺陷，包括心包水肿、血流减少或缺如、心律失常、出血和血栓形成。在1个细胞期时注入八种化合物中的一种。直到受精后第五天对心脏缺损的胚胎进行死亡率评估。

 

心脏功能的影响：研究甲基黄嘌呤对心脏功能的影响，测量在48小时的正常心率的胚胎。正常胎儿的心脏完整性包括正常的心脏结构和心血管终点。每种药物，从池中随机选择十个看上去正常的胚胎，在徕卡mz16f体视显微镜在安静状态和最佳温度下手动计数30S内每个胚胎心跳。每30秒心跳乘以2获得每分钟心跳即心率。美托洛尔，β受体阻滞剂可降低心率，作为内参。注射无菌水的胚胎作阴性对照。为了进一步了解功能性心脏效应是否可逆或不可逆，我们在每种药物浓度相同的胚胎中进行了相同的实验。测量从48到120 HPF的心率， 24小时的时间间隔。心脏跳动的测量步骤与前面描述的相同。

 

结果：胚胎毒性：由于斑马鱼胚胎的重量约为1.2毫克，在一个胚胎中施用1纳克的药物（1纳克/ 1.2毫克）大约等于1毫克/千克的药物。因此，用于注射药物的剂量均在1-20毫克/公斤的范围内。IBMX是最有毒的/活性化合物：大部分胚胎（58%）在注射1 ng的药物时显示死亡。二羟丙茶碱是最不活跃的甲基黄嘌呤；剂量高达20ng时，胚胎存活率高达90%。己酮可可碱和咖啡因也产生> 50%的死亡率，为了简化比较，我们观察到每种药物的最低致死率为20%。

 

一般毒性和形态缺陷：在48h和72h对获得胚胎进行形态缺陷观察。根据不同形态，对具有形态学缺陷的胚胎进行了鉴定，并将其分为轻度和重度表型。特别是胚胎发育不全、心率不齐、血液循环减少、心包轻度缺氧和卵黄囊水肿被归类为轻度表型。有缺陷的心脏，不规则的心跳，没有血液循环，心包和卵黄囊水肿被归类为严重的表型。药物浓度最高的形态缺陷胚胎的百分率随每个化合物的不同而不同。低剂量使用产生的胚胎形态缺陷< 10%， 2.5ng的咖啡因产生最高50%胚胎的形态学缺陷，1ng IBMX产生44%形态缺陷，5ng的氨茶碱产生29%的形态缺陷，1ng的茶碱产生24%的形态缺陷，7.5ng的多索茶碱产生23%的形态缺陷，5ng的乙羟茶碱产生15%的形态缺陷，20ng的二羟丙茶碱产生5%的形态缺陷。注射阳性对照DCA的胚胎有47%个形态缺陷，而注射无菌水的阴性对照组少于1%可见形态缺陷。这些胚胎主要有心包水肿、血液循环异常、卵黄囊水肿和AP轴形成异常。为了比较形态学缺陷，我们研究了每种药物至少20%的存活胚胎诱导形态学缺陷所需的剂量。结果表明，诱导至少20%的胚胎形态缺陷，己酮可可碱和茶碱咖啡因，IBMX，要求≤1ng的药物；氨茶碱与多索茶碱需要3-5ng药物。而二羟丙茶碱和乙羟茶碱最高剂量20ng和5ng时，造成的胚胎缺陷小于20%。

 

结构改变：对心脏结构改变的评估是在48小时完成。显示结构性心脏缺损的胚胎称为心脏表型，正常心脏形态的胚胎称为正常表型。计算每个化合物的胚胎心脏表型的总百分比。我们的结果表明，除二羟丙茶碱和乙羟茶碱外，所有其他药物最高剂量时诱导20-40%的胚胎心脏表型。造成至少10%心脏缺陷的最小剂量为IBMX 0.15 ng，咖啡因，己酮可可碱和茶碱0.25ng，多索茶碱1 ng，氨茶碱2.5ng, 乙羟茶碱5ng。二羟丙茶碱，在20ng的最高浓度时胚胎心脏缺损小于10%，心脏表型胚胎的进一步分析表明，大多数胚胎有2级心脏异常。心房和心室严重扩张，形状扭曲，边界不清晰。

 

功能改变：48h测量正常胚胎的心率来评估心脏系统功能的改变。每种药物每种浓度随机选择十个胚胎，计算心脏跳动次数。以无菌水处理的胚胎作为阴性对照，用美托洛尔处理的胚胎作为内部参照。结果表明，与对照组相比，除多索茶碱外所有甲基黄嘌呤药物会引起心率明显增加。多索茶碱没有改变心率而美托洛尔显著降低心率。72, 96和120 h对照组胚胎的心率无显著差异。

 

结论：我们研究了八种甲基黄嘌呤的一般和心脏毒性及致畸性。结果表明，除了二羟丙茶碱，在细胞分化阶段单次暴露这些药物可能导致胚胎毒性与致畸和心血管系统一般的结构和功能的改变。