摘要：本研究的目的是探讨静脉注射免疫选择stro-3 + 间质前体细胞（MPCs）对绵羊关节炎模型临床评分，关节病理和细胞因子产生的疗效。

 

方法：通过将牛II型胶原注射到左踝关节，最初对这种抗原有致敏作用，在16头成年绵羊上创建关节炎模型。24h后静脉注射给予绵羊1亿5000万异源绵羊MPCs（n=8）或生理盐水（n=8）。监测关节炎引起的跛行、关节肿胀和疼痛，并收集血液样本检测白细胞和细胞因子水平。诱导关节炎14天后对动物进行剖检，对关节炎（左）和对照（右）关节的组织进行大体和组织病理学评估。

 

结果：MPC处理的绵羊与生理盐水对照组相比，表现出明显的跛行、关节疼痛和肿胀的临床症状。它们也表现出降低软骨糜烂、滑膜间充质干细胞的活化和血管生成。同时伴有CD4+T淋巴细胞和CD14单核/巨噬细胞的滑膜组织浸润减少。在关节病变诱导3天后，给予MPCs动物的循环血液中中性粒细胞数目和血浆激活素A浓度显著降低。

 

结论：这项研究的结果已经证明静脉注射MPCs能减轻关节炎动物模型的关节炎临床症状和炎症介质对关节组织的破坏。

 

 

背景：中性粒细胞在类风湿关节炎（RA）的发生和发展中起着重要的作用，它们在受累关节的滑膜和滑液（SF）中大量聚集。它们除了具有强大的细胞毒性外，还通过细胞与细胞的相互作用，促进细胞因子和趋化因子的释放/激活，调节免疫应答。最近的研究也证实了他们通过嗜中性白细胞胞外陷阱参与自身免疫性疾病的能力。在中性粒细胞大量涌入后，有单核细胞进入组织巨噬细胞。这两种细胞都能起到抗炎的作用。在自身免疫性疾病，类风湿关节炎，突出的T细胞浸润表明，这些细胞也是关键参与者。关节炎小鼠模型已被广泛用于识别炎症和关节组织破坏的许多致病途径。然而，他们的高代谢率、低体重和短生命周期导致了人类RA的一些机制上的差异，特别是在他们对抗关节炎治疗药物的反应方面。踝关节炎性关节炎的一种可重复模型，这可以用来评估跛行的临床症状，炎性反应过程中滑膜液和滑膜的改变及软骨的侵蚀。像绵羊这样的大型动物模型的主要优点是关节的解剖和通过周围关节传递的承重应力与人类相媲美。由于生物力学因素是关节组织内稳态和失败的重要因素，我们认为对这一物种跛行的评估比啮齿类动物更能与人类疾病相关。关节炎诱导后，绵羊CIA模型显示受影响关节的疼痛和肿胀很快。其次是轻度慢性关节炎的发展。从实用的角度来看，绵羊CIA模型也有啮齿类动物模型的优点，关于关节内注射的目标关节的易接近性，相对于获得目标节点缓解关节内注射，收集多种流体样品和建立淋巴管以监测细胞群退出关节的能力。成人骨髓间充质干细胞（MSCs）可以分化为中胚层来源的细胞（包括骨、软骨、肌腱），首先开发治疗，以期利用其再生能力。然而，大量的研究已经报道了这些细胞在体内和体外调节免疫系统功能的能力。在胶原诱导性关节炎（CIA）的啮齿类动物模型中，MSC治疗的研究数量有限，报道了混合治疗和非治疗效果。MSC来源、分离和培养技术、剂量、路线和使用时间方面的差异都可以解释观察到的可变结果。然而，这些研究中有几项报道了有前途的治疗效果，包括抑制T细胞活化和减少促炎性细胞因子的产生。间质前体细胞（MPC）是一个有限子集的骨髓间充质干细胞，当免疫筛选STRO-1或STRO-3时与普通细胞相比增加克隆形成，发育和增殖能力。在本研究中，我们利用了关节炎的绵羊CIA模型对假设进行检验，单剂量的1亿5000万静脉注射异基因本身会减少关节炎的临床症状，改善白细胞升高，特别是中性粒细胞，减少关节炎细胞浸润，滑膜增生，基质活化和软骨破坏。

 

方法：动物：购买16只2岁的绵羊，在试验开始前适应环境至少2周。MPC组一只羊被排除在研究之外，由于并发肺部炎症性疾病，与研究无关，以八只对照羊和七只MPC处理的绵羊为研究对象。

 

关节炎诱导：绵羊关节炎模型是以动物对II型胶原（BCII）的致敏作用为基础的。绵羊随机分为两组。BCII从牛的气管软骨用胃蛋白酶消化和盐沉淀法制取。用牛气管软骨II型胶原的工业样品对羟脯氨酸含量进行了生化分析，证实了该制剂的纯度。一批当时冻干和存储在-20°C和用于所有的动物。冻干BCII溶解在4°C， 50 mM醋酸，重组样本存储在80°C。溶解的胶原蛋白乳化与弗氏完全佐剂（FCA）用等量体积混合。绵羊皮下注射5mg/ml的BCII-弗氏完全佐剂第0天对胶原敏感。第14天对其进行免疫加强再次注射，两周后（第28天）100μg BCII溶解在0.5毫升生理盐水注射左踝关节。两组绵羊均有左踝关节炎。

 

间充质前体细胞治疗：4ml的DMSO /αMEM中每ml中含有3000万MPC（异体，STRO-3 +羊的间质前体细胞）。绵羊STRO-3 + MPC进行免疫选择和扩大培养传代P5正如先前所描述的。在解冻、细胞计数和存活率测定（台盼蓝排除法）后，1亿5000万的MPC立即注入100ml的0.9%无菌盐水。通过预先放置的颈静脉（IV）管，进行30min的注射。对照组绵羊接受生理盐水。

 

临床跛足评分：临床跛行的评估采用半定量评分系统，如前所述。跛行评估包括行为、站立姿势和步态的参数。关节肿胀的临床症状被评定为0（未检测出），1（几乎看不出），2（明显可识别的肿胀）和3（非常明显的关节肿胀）。屈曲疼痛被评定为0（没有引起），1（轻微屈曲不适），2（明显的不适和强烈的屈曲）和3（严重的不适，即使有轻微的屈曲和绵羊非常不愿意弯曲关节）。每星期进行一次，直到IA胶原注射（第28天），然后在注射后第29, 30, 31、32, 34, 36、42天进行跛行、关节肿胀和屈曲疼痛的评估。所有评估人员对分组不知情。

 

样品收集：每周从颈静脉收集血液直到第28天，然后在关节炎诱导后每日一次，连续3天，然后每隔2 - 3天采集一次。诱导关节炎2周后（第42天）处死羊，进行尸体检验。收集滑膜（SM）、软骨、滑膜液（SF）。记录每个组织的大体结果，并从左、右关节背侧采集SM。固定包埋、HE染色并检查。

 

细胞因子的检测: 用ELISA法测定血浆白细胞介素的浓度（IL）- 17A和激活素A，滑膜液。

 

踝关节软骨的宏观评分：正常的软骨表面 = 0；粗糙的软骨表面而不深或广泛的裂隙 = 1；清晰的颤动和表面裂纹 = 2；全深度磨损小局限于滑车沟  = 3；全深度侵蚀扩展到相邻的外髁滑车槽=4；各治疗组对两名盲观察者的平均值进行汇总。

 

踝关节滑膜组织病理学评分：评分系统评估滑膜的三个参数，即内膜增生、间质激活和炎性浸润（0～3分），最终得分为这三个总分，最大得分为9分。为了一致性，滑膜内膜增生在细胞深度上进行了特别评价。滑膜内膜从正常（1 - 3细胞，0分）到中度弥漫性增生（6多个区域厚的细胞，3个点）。滑膜基质激活与炎性浸润是基于这些改变最大的区域。激活的程度范围从没有（0分）与慢性水肿明显活化，显著纤维化和细胞，包括内皮细胞和组织细胞（3分）。滑膜的炎性浸润，从没有炎症（0分）到明显的炎症浸润不等，，包括淋巴细胞、浆细胞和组织细胞，在滑膜间质细胞，滑膜内膜和血管周围的位置大量聚集（3分）。大面积坏死常伴有严重的炎症。病理改变由双盲观察者评分，如果分数相差2分以上，则由第三盲观察者进行检查。

 

踝关节组织免疫组织化学染色的评分：基于近似的单元计数和/或单元簇的大小和数目评估SM染色的单核炎症细胞类型（0–6）。所采用的标准是：0 = 没有细胞在整个截面；1在整个截面 = ＜10细胞；2 = 10–50细胞和/或1–2小细胞群；3 = 50–200细胞和/ 或 小–中细胞群或许多细胞系细胞；4 = 200–500细胞和/或多小-中细胞群；5 = 500–1000细胞和/或多中-大细胞群； 6 >  =1000细胞和/或超大型集群的细胞系。

 

结果：临床评估：关节内注射胶原引起轻度至中度跛行，局部关节肿胀和疼痛的屈曲，在所有绵羊24小时后可以检测到。从第29天到第42天检测到所有的跛行和炎症的迹象，然后稳步下降。治疗组在31～36天内跛行评分显著降低。与生理盐水对照组相比，MPC治疗组的跛行总体上有了明显的改善。治疗组第34天跛行率平均下降1，而未治疗组在第42天平均值仍大于1。对于弯曲疼痛，与生理盐水组相比，在第42天几乎没有疼痛，MPC治疗组有更快速的改善。疼痛评分在第31天至36天之间显著改善。虽然肿胀是轻微的，但在MPC治疗组第31天和第34天的肿胀评分都显著降低。在结合所有三个临床参数后，第31和第36天的评分再次显著改善。

 

总白细胞计数（WCC）：两组治疗后血白细胞总数明显增加，这主要是由于中性粒细胞数。在MPC治疗后，血液中中性粒细胞的数量下降得更快，而静脉滴注后2天的中性粒细胞数量明显减少。类风湿关节炎诱导后血液淋巴细胞和单核细胞数无明显变化，治疗对其数量无影响。

 

滑液中总白细胞和白细胞计数：左侧关节炎SF的总白细胞计数明显高于右前关节，但在左侧和右侧关节的中性粒细胞计数没有显著差异。经过一段时间后，白细胞计数下降，治疗组与对照羊左踝关节滑液细胞数无显著差异。然而， MPC处理的绵羊在左踝关节滑膜液中的中性粒细胞的数目与生理盐水组相比减少了。

 

血液炎性标志物：激活素A:与未治疗组相比，MPC治疗组的激活素A显著降低。IL-17A：MPCs治疗后的2天血浆中IL-17A显著降低。关节液炎症标志细胞因子激活素A、IL-17A和IFN-γ显著升高，但IL-10没有显著变化。

总关节病理学：左跗关节表现出深刻的病理变化。包括关节肿胀、总的SM增厚和距骨和胫骨远端关节面出现局灶性软骨侵蚀。生理盐水对照组左侧踝关节的变化幅度明显，但MPC注射组不太明显。

 

结论：本研究利用绵羊炎性关节炎模型证实，每种动物单次静脉注射1亿5000万种同种异体免疫抑制剂有效地减少了关节炎的临床症状和关节炎的大体病理变化。治疗还减少滑膜组织基质激活、CD4 + T细胞和单核/巨噬细胞在滑膜和滑膜血管生成中的组织病理学改变。MPC处理显著降低血中性粒细胞和相关的炎症标志物如激活素A。这项研究表明，MPC能够调节炎性反应在绵羊模型胶原诱导的关节炎反应，导致局部和全身炎症反应的下调。这些数据支持了MPC对急性炎症组织如关节炎治疗中的潜在应用。