摘要：探讨索拉非尼抑制VEGF上调的促瘤作用的最佳治疗起始时间，临床实践中常见的局部治疗。

 

方法：经局部肿瘤治疗，如TACE，静脉注射VEGF模拟其表达。40只有肝肿瘤的SD大鼠随机分为四组，在不同的时间点给予索拉非尼：（A）对照组：仅注射VEGF；（B）在VEGF注射前72小时使用索拉非尼；（C）同时与血管内皮生长因子注射是使用索拉非尼；（D）血管内皮生长因子注射后72小时开始使用索拉非尼。比较免疫组化（IHC）检测肿瘤生长速度、平均存活时间、VEGF的表达及微血管密度（MVD）。

 

结果：使用索拉非尼三个组的肿瘤大小、平均存活时间与对照组相比有显著差异。A，B，C，D组平均存活时间分别为19.6 ± 1.78、31.2 ± 6.99、27.4 ± 4.9和26.5 ±4.6天。此外,B和D组在统计学上有显著差异。取肿瘤进行HE染色及免疫组化检查。B，C，和D组VEGF表达水平分别为42.8 ± 7.96、71.9 ± 15.73和73.6 ± 13.73，均明显低于对照组。此外，对照组MVD水平为109.2 ±  8.98，显著高于三个索拉非尼组。

 

结论：根据我们的研究结果，给予索拉非尼最合适的方案是在vegf表达增加之前，这表明一个潜在的优势，通过抑制VEGF及VEGF受体的表达控制肿瘤的生长和延长试验动物的生存时间和减少肿瘤血管的生成。

 

 

简介：肝细胞癌（HCC）是世界范围内癌症死亡的第二大原因，肝脏被认为是最常见的血源性肿瘤转移部位。局部治疗（TACE）被认为是治疗中晚期肝癌的有效治疗方法。这些治疗只维持病灶的短期稳定性，并提供有限的生存益处。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管生成的最有力的调节因子之一，在肝癌局部治疗后显著升高，被认为是肿瘤残留和复发的重要因素之一。到目前为止，抗血管生成的多激酶抑制剂，索拉非尼，阻止Raf丝氨酸激酶和受体酪氨酸激酶的活性，如VEGFR-2，PDGFR-β、c-KIT、FLT-3，RET，导致肿瘤细胞增殖和新生血管形成的抑制作用。索拉非尼独自在BCLC C期肝癌的疗效已得到证实。然而，其局部反应为3.3%，索拉非尼治疗6.5个月后出现耐药性。在描述病情，BCLC分期C包括合并门静脉癌栓还不够全面（PVTT），而主干或分支门静脉癌栓不在这个阶段明确区分。肝动脉化疗栓塞治疗门静脉癌的安全性和有效性已被证实。事实上，两种治疗没有明确的禁忌，大多数患者B和C阶段联合治疗，如TACE + 索拉非尼，能有更好的预后。回顾性研究表明，TACE联合索拉非尼  对中晚期HC患者有益。同时，我们发现不同的研究采用了不同的模式和给药时间。显然，这些差异可能导致这些试验的争议。本研究通过动物实验研究索拉非尼治疗联合用药的最佳起始时间点。

 

方法：肿瘤细胞和动物：Walker-256肿瘤细胞，4周龄BALB/c裸小鼠（体重12–15 g；N = 2）在大腿外侧一个位置进行肿瘤细胞注射；5 - 7周龄的雄性SD大鼠（体重150–200 g；N = 50）进行肝内肿瘤接种。动物饲养在SPF条件下，温度23 ± 3°C和相对湿度50 ± 10%。

 

皮下肿瘤模型的建立：Walker 256肿瘤细胞用于肝肿瘤模型的建立，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS，16.5 mM磷酸盐，137 mM氯化钠，和2.7 mM氯化钾， pH为7.4）将肿瘤细胞悬浮液稀释至107细胞/ ml，并在BALB / c裸鼠大腿外侧处皮下接种。肿瘤细胞接种约9天后，注射部位可发现直径约1厘米的皮下肿瘤。

 

肝癌模型的建立：使用先前描述的方法进行肿瘤植入。从供体动物皮下获得肿瘤后切碎，SD大鼠经下腹正中切口开腹，用10%水合氯醛在剂量300 mg/kg下进行腹腔麻醉。肝左外侧叶伸出腹腔。使用眼科镊子制备包膜下隧道的深度大约2-3个的叶厚度。一个实体肿瘤块被插入隧道。创面覆盖一小块明胶海绵。止血不是必要的，所有实验大鼠在术后恢复正常，第二天恢复正常活动。

 

实验性治疗：植入后十天，用磁共振成像（MRI）评价肝肿瘤模型的建立。实验动物腹腔注射水合氯醛麻醉，然后进行MRI扫描。扫描参数为：回波时间：T1WI为82ms， T2WI为1.5ms，重复时间T1WI为1500ms， T2WI为508.7ms，T1WI及T2WI的重建层厚为5 mm。40只符合的肝肿瘤大鼠被随机分为四组：A组为对照组，其动物仅接受VEGF（20毫克/升，1毫升/公斤，体重）注射。B组（B组，n = 10  ）VEGF注射前72 h进行索拉非尼（100 mg/kg体重）灌胃。C组（C，n = 10）进行索拉非尼灌胃同时与血管内皮生长因子注射。D组（D，N = 10  ）血管内皮生长因子注射后72 h用索拉非尼灌胃。索拉非尼口服每日一次，连续10天，剂量水平为100毫克/公斤体重。重组大鼠VEGF165（20毫克每管）1000 rpm离心30秒，溶解在100毫升去离子水，并用所需浓度的生理盐水稀释。B、C、D组大鼠注射20 mg/L VEGF。

 

影像学和病理学研究：磁共振成像用于评价肿瘤和腹水的发展。为确保肿瘤组织的肝移植，并在索拉非尼治疗10天后监测肿瘤和腹水的发展。在肿瘤快速进展的情况下，的动物一般情况下，根据皮毛、营养摄入量和行为进行每天评估。在动物死亡后，分析和比较大鼠肝组织标本的MVD和VEGF。我们使用兔抗鼠VEGF多克隆抗体和兔抗鼠CD34抗体。

 

血管内皮生长因子与微血管的检测与计数：由两位资深病理学家对每一张幻灯片独立确定血管内皮生长因子蛋白表达和MVD水平。每例玻片计数100个上皮细胞，检测上皮细胞呈阳性反应，计数五个随机点，计数染色上皮细胞。用平均CD34阳性微血管计数检测肿瘤血管。光镜检查，五个染色微血管数目最多的区域被鉴定为“热点”。对微血管定量，我们数了五个“热点”使用200×放大视野，取其平均值。在坏死或炎症区域不进行计数。五个“热点”无法识别的部分被排除在进一步分析之外。如果两个病理学家有显著的差异，再次进行回顾，直到他们达成共识。

 

结果：肝脏可检出肿瘤的生长：肿瘤组织植入后10天，用MR常规扫描证实SD大鼠肝脏是否存在肝肿瘤。记录肿瘤的大小和位置图像。可发现的肿瘤，不包括腹壁或腹腔内的肿瘤，接受以下实验：索拉非尼给药10天后，我们用MR扫描测量肿瘤大小。以肿瘤的最大直径为评价指标。

 

平均存活时间：A，B，C，和D平均存活时间分别为19.6 ± 1.78、31.2 ± 6.99、27.4 ± 4.9和26.5 ± 4.6天。结果显示索拉非尼组与对照组生存时间差异显著。B组和D组之间存在显著性差异。然而，B组和C组和C、D组无统计学差异。

 

病理学检查：实验动物自然死亡后，采集肝肿瘤标本进行HE染色。如图所示，正常的小叶结构消失，肿瘤细胞被排列成片状或巢状。肿瘤细胞的细胞核有高频率的有丝分裂。肿瘤非典型细胞明显，如双核甚至多核。可见大片的嗜酸性斑是肿瘤坏死区。四组肿瘤形态无明显差异。相比于索拉非尼组，对照组的肿瘤细胞体积小，拥挤，尺寸和形状变化更为显著。

 

免疫组化：肝癌VEGF表达呈棕色染色，主要分布在细胞质中。对照组用免疫组化法检测大量VEGF阳性血管内皮细胞。在对照组中VEGF阳性细胞样本的数量，88.3 ± 13.61，高于B，C，和D 索拉非尼组42.8 ± 7.96，71.9± 15.73和73.6 ± 13.73。VEGF在B组与D组之间逐步回归表达，表明索拉非尼早期的给药有更为明显的抑制作用。CD34阳性细胞呈棕黄色或深棕色染色。四组MVD的变化趋势与VEGF相似。对照组与索拉非尼组之间存在统计学差异。

 

平均存活时间与肿瘤的关系：VEGF和MVD常用于评估肿瘤血管生成活性：它们是一致的，相关系数为0.875，为阳性。利用皮尔森连续变量的相关分析，VEGF和平均存活时间的皮尔森系数积矩相关为0.78，为阴性。MVD与平均存活时间呈负相关，为0.794。

 

结论：给予索拉非尼最合适的方案是在VEGF表达增加之前通过抑制VEGF及VEGF受体的表达控制肿瘤的生长和延长试验动物的生存时间和减少肿瘤血管的生成。