摘要：虽然斑马鱼和青鳉是原始脊椎动物，但已经超过了其他的动物，成为最常用的模式生物。斑马鱼胚胎的基因表达模式、调控顺式元件识别和基因功能的研究可以通过一些技术来促进斑马鱼胚胎的发育，包括转基因，体内的瞬态试验，通过注射mRNA基因的过度表达，通过吗啉代寡核苷酸注射敲除，利用CRISPR/Cas9系统突变敲除和编辑基因。此外，具有组织特异性报告的转基因鱼的转基因株系已成为生物科学研究的有力工具，因为在透明胚胎中可视化特定基因的动态表达是可能的。特别是，一些转基因鱼系和突变体显示出与人类疾病相似的缺陷表型。因此，种类繁多的鱼类模型不仅揭示了体内疾病发病机制的分子机制，而且为高通量筛选候选药物提供了一个生存平台。有趣的是，转基因鱼也可以作为生物传感器来检测环境污染物，甚至作为宠物鱼展示美丽的荧光颜色。因此，转基因模型鱼具有广谱的现代生物医学研究中的应用。

 

 

背景：虽然斑马鱼和青鳉是原始的脊椎动物，他们比其它动物模型有如下几个优点。例如：光可以控制自己的排卵。产卵频繁，产卵季节没有限制。微量受精卵易于获取且相对便宜。它们的胚胎是透明的，可以方便地监测体内各种组织和器官中的动态基因表达，而不需要牺牲实验对象。它们的基因组大小大约是哺乳动物基因组的20到40%，使它们成为唯一用于大规模突变的脊椎动物。他们的成熟时间只需要2 ~ 3个月，比较省力省时产生转基因株系。此外，许多常规的分子生物学和遗传学技术，包括敲入和敲除，在模型鱼中得到了很好的发展。

 

遗传能力：一旦外源基因成功地转移到胚胎中，然后将稳定的种系传递到f1代，就可以建立F0转基因系。一般来说，大约10 - 20%的处理过的胚胎有机会实现种系传递。已有报道表明，外源基因伴随着腺相关病毒的反向末端重复序列，可以提高转基因鱼类的普遍表达和转基因的稳定传递。同时，转基因技术可以通过使用来自青鳉Tol2转位子。一项尖端技术已将鱼类基因转移研究推向了新的视野，如敲除斑马鱼的转录激活因子样效应核酸酶系统和集群定期间隔短回文重复CRISPR相关结合蛋白9 。

 

转基因荧光鱼：荧光蛋白基因（FPG）作为报告基因用于荧光显微镜下直接观察体内的转基因的表达。许多转基因模型鱼含有各种组织特意性启动子驱动的荧光蛋白基因，包括红系特异的转录因子GATA基因启动子、α肌肉特异性肌动蛋白启动子、视紫红质特异性启动子、神经元特异ISL-1启动子、胰腺PDX-1和胰岛素启动子、心肌特异性cmlc2启动子、肝脏特异型L-FABP启动子、骨特异性COL10A1启动子，巨噬细胞特异性启动子和MFAP4，生殖细胞特异启动子基因。

 

生物医学研究的新材料：（a）发育生物学  心脏发育：斑马鱼研究心脏发育的原因如下：（一）在受精后48个小时（HPF）斑马鱼有原始的心脏形态。（b）在具有FP标记心脏的转基因株系中很容易观察到心脏发育。（c）有缺陷的心血管系统的斑马鱼胚胎仍能通过从水中获得扩散的氧气而继续生长。（d）通过简单的单倍体突变方法可以促进心脏发育相关基因的发现。例如，利用斑马鱼jekyll突变制备缺陷的心脏瓣膜，Stainier等人发现斑马鱼胚胎发育正常心脏瓣膜需要UDP-葡萄糖脱氢酶。Tsai的实验室是第一个产生具有绿色荧光标记心脏的转基因斑马鱼系的实验室。已经开发出心脏发展的4D动态图像。tbx1对第二心脏区的增殖起到促进作用，根据该转基因株系采集的心脏祖细胞，可以分析心脏特异基因的表达模式。对不同发育阶段的基因或蛋白质表达动态进行分析。此外，这一转基因鱼是一个潜在的平台，用于检测影响心脏发育的化学物质、药物和环境污染物，详情见下文。

 

肌肉发育：在动物胚胎中对注射的DNA片段进行体内瞬态检测是分析调控顺式元件功能的一种简单而有效的方法。例如，Myf5，一个成肌调节因子（MRF），在规范肌肉的原始细胞分化过程中扮演着重要的角色。Myf5表达体节特异性和阶段依赖性，它的激活和抑制都是精心策划的。采用体内瞬态试验发现一个新的顺式作用元件位于-82/62对Myf5体节特异表达是必不可少的。除了调节体节，Myf5也参与颅面肌发育。Myf5在肌肉和软骨发育的功能是独立的。因此，三个可能的途径，可以和Myf5和Myod之间的分子调控有关：（1）Myf5独自能够启动肌肉基因。（2）MyoD启动肌肉原基（3）MyoD单独，但不是Myf5，调节肌肉原基的发育。此外，该six1a基因被发现在Myf5和Myod之间的相互作用中发挥重要作用。

 

眼神经发育：鲤鱼视紫红质基因的视网膜特异表达受两个上游调控的DNA顺式元件控制。一个是位于−63−75，这是鲤鱼神经视网膜亮氨酸拉链反应元件；其他位于−46−52，这是一个鲤鱼青视网膜特定元素至关重要的报告基因的表达。有趣的是，直接激活的早期生长反应的转录调节基因可导致视网膜和晶状体的分化不完全，导致小眼球。眼发展的另一个重要的因素是ADP-核糖基化因子6相互作用蛋白1（arl6ip1）。arl6ip1功能的丧失导致视网膜神经元缺失，无序的视网膜层和较小的视杯。在失去arl6ip1，视网膜祖细胞持续表达细胞周期蛋白D1，提示眼祖细胞保持在早期祖细胞阶段，而不能退出细胞周期分化。Tu等人发现arl6ip1突变导致异常的神经嵴衍生组织以及神经嵴说明符基因表达降低，如FOXD3，snail1b和SOX10，表明arl6ip1参与规范，但不诱导，神经嵴细胞。

 

造血：虽然斑马鱼的主要造血部位不同于哺乳动物，但斑马鱼和哺乳动物都有共同造血系统产生的所有主要血细胞类型。此外，许多涉及造血的基因和信号通路在哺乳动物和斑马鱼中是保守的。例如，SCL是早期造血细胞中表达的第一个转录因子之一，在进化上是保守的。斑马鱼的基因筛选产生了许多与血液相关的突变体，有助于研究人员了解造血基因及其功能。

 

斑马鱼作为人类疾病的动物模型    心血管疾病：模式鱼是研究人类疾病的优秀材料，因为一些突变体表现出与人类疾病相似的表型。此外，控制组织或器官发育的基本基因及其调控是高度保守的。例如，TBX5是一个T-box转录因子负责细胞类型的规范和形态。TBX5突变表型与斑马鱼和哺乳动物之间是高度相似。因此，具有心脏特异性荧光的转基因鱼可以为心血管疾病药物提供高通量筛选平台。例如，Tsai实验室建立了一个转基因株系，可以诱导心肌肌钙蛋白C在胚胎、幼虫或成鱼等发育阶段的表达水平下降。肌钙蛋白c的减少导致了扩张型心肌病的模仿和人类的不完全性房室阻塞性疾病。因此，该转基因株系有望为药物筛选和阐明心血管疾病的分子机制做出重大贡献。其次，研究了药物对胚胎发育的影响。胺碘酮，这是III类抗心律失常药物被用于治疗快速性心律失常的人。然而，胺碘酮治疗斑马鱼胚胎被发现在心脏中表现出血液回流。后来的研究表明胺碘酮导致心瓣膜形成失败。具体而言，胺碘酮引起类似的聚糖B异位表达（s-vcanb），导致EGFR和GSK3β/蜗牛信号抑制，这反过来，上调心脏CDH5，导致有缺陷的心脏瓣膜。此外，还发现胺碘酮抑制乳腺癌细胞的转移。一种类似胺碘酮抑制心脏内EMT转变的现象。虽然斑马鱼两腔心，相对于小鼠、大鼠和家兔的心率，动作电位持续时间（APD）和心电图（ECG）形态类似于人类。此外，Tsai et al证明斑马鱼心脏体外心电图记录是一种简便、高效、高通量的检测方法。因此，斑马鱼可以作为一个平台，直接测试药物对APD延长和QT间期延长的影响，这是FDA批准药物审批的必要条件。

 

癌症研究：黑色素瘤  斑马鱼已成为人类癌症研究的热门实验动物，部分原因是由于人类癌基因和抑癌基因的鱼类同源物已经被鉴定出来，部分原因是因为调控肿瘤发展的信号通路是保守的。Amatruda等人报告说，许多斑马鱼肿瘤在组织学检查中与人类癌症相似。具有皮肤特异性红色荧光的斑马鱼转基因株系可用于皮肤肿瘤的检测。用含砷溶液处理该胚胎后，在荧光显微镜下可以很容易地识别出皮肤上诱发的肿瘤。因此，该转基因株系有望用于皮肤病的研究。例如，在这种转基因株系中，红色荧光表达可筛选出常见的皮肤癌黑色素瘤。斑马鱼转基因株系也可用于建立模拟黑色素瘤发育的模型。人类致癌BRAF V600E表达的斑马鱼mitfa启动子控制下的黑色素细胞黑色素瘤模型的建立。皮肤特异红色荧光mitfa驱动基因表达相结合，黑色素瘤可以很容易地追踪。因此，转基因株系和突变体为人类疾病的机理研究和治疗研究提供了丰富的资源。

 

癌症研究：转移  斑马鱼是体内肿瘤生物学研究的又一替代生物。特别是，将人类癌细胞移植到斑马鱼胚胎中作为评价癌症进展和药物筛选的另一种方法。例如，用荧光标记的人类原代肿瘤细胞已经被植入斑马鱼肝脏，这些细胞的侵袭和转移是直接观察和容易追踪的。为探讨局部癌细胞侵袭的机制，用荧光标记的人脑胶质瘤细胞进入斑马鱼胚胎脑内。通过嫁接少量高转移性人乳腺癌细胞在48 HPF斑马鱼胚胎心包膜，肿瘤细胞沿主动脉纵向移动。同样，高转移性人肝癌细胞荧光标记分别注入48斑马鱼胚胎心包。之后，我们可以想象癌细胞是如何进入血液循环并在头部和尾部的小血管中被捕的。斑马鱼胚胎注射致瘤胶质瘤的转移，包括不同阶段的干细胞 开始，接近，聚集，入侵，迁移，和永恒轮回。因此，将少量标记的肿瘤细胞嫁接到透明斑马鱼胚胎中，使我们能够动态监测癌细胞，而不受免疫抑制的干扰。斑马鱼模型除了用于分析肿瘤扩散和转移的机制外，还可用于筛选潜在的抗癌化合物或药物。此外，斑马鱼具有基因操作简单、周期短、重复性好、维护成本低、胚胎高效电镀等优点。因此，这种鱼仅次于SCID和裸鼠作为肿瘤细胞的异种移植接受者。

 

癌症研究：白血病  白血病是一种与造血有关的癌症。白血病通常是由白细胞的异常增加引起的。然而，一些人类骨髓癌和血液来源的父母细胞来自其他血细胞类型。寻找有效的白血病治疗方法正在进行中。有趣的是，斑马鱼与人类的造血发育过程和基因相似，使斑马鱼成为白血病研究的可行模型。此外，在斑马鱼的基因表达可以通过几种方法，方便修改，如钼诱导的基因沉默，TALENs和CRISPR/Cas9基因敲除，DNA / RNA过度表达。

 

癌症研究：肝癌  kras, xmrk 和 myc肝癌特异性表达的几种转基因肝癌模型已被报道。 这些转基因斑马鱼肝脏肿瘤通常产生不同程度的肝细胞腺瘤。这三个转基因肝癌模型已被用于通过RNA-SAGE测序鉴定差异表达基因。例如，研究人员在三种肿瘤模型中搜索或下调了基因，并分析了可能的信号通路。然后，确定了斑马鱼肝脏肿瘤特征与人类肝癌的不同阶段之间的关系. 肿瘤的高发病率和方便的化学治疗使这一转基因斑马鱼成为研究肝肿瘤进展、消退和抗肿瘤药物筛选的理想平台。

 

行为研究: 有趣的是，斑马鱼成为研究抑郁症的现代有机体。因为生理（神经解剖、神经内分泌、神经）和斑马鱼的遗传特性类似于哺乳动物，斑马鱼是高通量遗传和化学遗传筛选的理想选择。此外，由于斑马鱼对认知、回避和社会范式的行为测试是可用的，识别抑郁响应生理指标的遗传，环境和/或精神药物的改变是可行的.事实上，斑马鱼表现出高度健壮的神经行为障碍表型，如焦虑和回避行为。此外，行为指标的新的信息可以接触，包括通过自上而下垂直运动趋地性.斑马鱼的行为也可以使用自动化的行为跟踪软件的监控，从而提高效率和降低差异. 此外，斑马鱼提供了一个潜在的洞察抑郁症的社会方面视角，可能是适合研究抑郁症的认知缺陷及其公认的病因途径。斑马鱼对精神药物高度敏感，如抗抑郁药、抗焦虑药，情绪稳定剂和抗精神病药物，作为药物发现的重要工具。

 

环境毒物生物传感器：目前正在使用芳香烃、重金属和环境雌激素来测试环境污染物对动物的影响。这些研究主要集中在死亡率和异常率方面。然而，发育中的胚胎可能已经以细微的方式被破坏，无法直接观察形态学和检测死亡率。为了克服这一缺陷，转基因鱼可以用于研究（a）有毒物质是否导致胚胎发育过程中的缺陷基因；（b）污染物是否影响组织特异性基因的表达；（c）污染物对胚胎发育的影响是否取决于剂量依赖性。通过简单观察鱼在污染物之前或之后的形态变化。转基因模型鱼作为环境毒物和诱变剂的指示生物。

 

结论：越来越清楚的是，转基因鱼模型是一个强大的生物材料，用于研究多种学科，包括分子生物学、发育生物学、神经生物学、癌症生物学和再生医学。它提供了一种简单而有效的活体鉴定DNA序列的方法，以及确定基因功能和分子途径。更重要的是，越来越多的文献报道，（a）模型鱼突变体的缺陷表型可以与已知的人类疾病相重叠；（b）药物对斑马鱼和哺乳动物系统也有相似的作用。转基因鱼类模型为生物医学领域高通量药物筛选提供了一个有用的平台。此外，它可以作为一个环境指标，在我们的日常生活中检测污染物。然而，这种鱼类模型有一些局限性和注意事项。首先，不同于哺乳动物，鱼类缺乏心脏分隔，肺，乳腺，前列腺和四肢，使鱼模型不可能为这些组织和器官的研究。此外，鱼类没有胎盘，因此鱼胚胎直接暴露在环境中而不涉及胎盘。二，鱼是变温通常维持在30°C，对于那些适应37°C的哺乳动物来说，这可能不是最佳的。最后，由于斑马鱼基因组是四倍体，所以对某些基因进行功能研究就不那么直接了。