摘要：行为学是理解神经系统疾病发展和病理的重要工具。斑马鱼是一种新兴的行为和神经研究模型因为斑马鱼的行为能力类似于人类，其神经系统结构和功能是高度保守的。通过光/暗周期的节奏或食物的卡路里含量的变化。研究野生型斑马鱼自由泳白天/夜间自发活动的改变。应用交替小振动，将斑马鱼幼虫暴露于持续的压力下。在光周期变化规律下，斑马鱼幼虫仍表现出明显的光/暗活动模式，但总活性较对照组减少。幼虫暴露在连续光照下，协调休息周期后，但最大活性和激发率均升高，表明食物成为新的授时因子。喂食高热量食物会在光周期中呈现持续高活性水平，并在黑暗中显著提高活动水平。暴露于连续的振动降低了总的活动水平。环境因素的变化如光/暗周期或食物热量含量的变化可以影响脂肪细胞，脂质成分和自由泳的昼夜节律，但这是第一次展示这些因素改变行为。

 

 

简介：斑马鱼是发育生物学中公认的模型物种，是行为学和神经学研究中新出现的替代模型。它们的行为方式与啮齿类动物和人类相似，神经系统结构和功能高度保守。斑马鱼在胚胎发育的120小时内，发育成一个复杂的神经系统。经过1周的发育，斑马鱼幼虫已经表现出与成年人一样复杂的行为模式。斑马鱼幼虫在游、转和捕捉祈祷时显示出明确的运动指令。斑马鱼的行为很容易被自动化的视频跟踪系统监控，由于幼虫的体积小，这些实验可以在多孔板，培养皿，或小槽开展直至成年期。斑马鱼的行为测试越来越多地用于神经毒性研究以及研究诸如阿尔茨海默病或痴呆等神经系统疾病。斑马鱼的行为与人类相似，可以受到环境因素的影响，如光和温度变化以及外界刺激，如化学物质或声音/振动。活动和休息时间是由昼夜节律决定的。与人类一样，斑马鱼在黑暗期表现出昼夜活动模式和休息。受精后20小时左右，斑马鱼对光出现反应。受精后的第一天，对短暂的闪光他们的反应是重尾抽搐，，而受精后5天（DPF），出现一个明显的昼夜活动规律表达。斑马鱼对振动也高度敏感，并有强烈的逃避反应。振动检测，斑马鱼发展两机械感觉系统：内耳和侧线。从受精后5天开始，当耳石的钙化和鳔充气，斑马鱼幼虫对声信号反应惊人。振动可以被看作是最强的应激刺激之一，斑马鱼调节自适应应激反应的下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴与人的方式类似。一般说来，斑马鱼对环境变化反应灵敏。已有许多研究调查环境因素对受精后幼虫直至6 DPF的行为影响。摄食和光/暗周期的变化也能改变游泳行为。斑马鱼幼虫在黑暗中表现出活动模式的改变，这种效应与昼夜节律基因的变化有关。另外，食物剥夺对活动模式的双相影响首先导致更高的活性，其次是活性降低。但目前还不清楚环境因素的变化，如热量食物含量，白天/黑夜周期的变化，以及持续的压力暴露，如振动刺激对幼虫正常基线行为的影响。在以前的研究中，我们已经可以证明改变的日/夜循环和食物含量明显影响脂肪细胞，脂质成分，和斑马鱼幼虫的昼夜节律，但我们没有调查行为活动的影响。为了更深入地了解环境因素对活动模式变化的影响，我们进行了以下研究。我们研究了TL野生型斑马鱼在光/暗周期或食物的卡路里含量的节奏变化。此外，我们还将斑马鱼幼虫暴露在持续7天的声音/振动中。通过比较不同环境因素下的总活性、昼/夜活动和兴奋率，我们能够清楚地表明，光/暗周期、食物和连续振动的暴露都会显著影响基线运动行为。

 

材料和方法：实验设计：选用野生型IL斑马鱼，一孔约30个个体。在产卵后不久，将卵混合并转移到胚胎培养基中（5 mM NaCl，0.17 mM KCl、0.33 mM氯化钙和0.33mM硫酸镁），胚胎和幼虫在温度（26°C）和光（14/10光/暗）培养条件下孵化。从受精后第6天，添加婴儿辅食，一天两次。在胚胎培养基中加入煮沸的鸡卵黄代替一次喂养，喂食4毫升的悬浮液。幼虫在灯亮后1h和灯灭后2h被喂养。这两个时间点被选中，以确保可比较的饲养条件。监测通常在标准条件下（8 DPF）开始，以规范实验，检查幼虫在实验前的正常行为。在第9天，开始了不同的实验条件：时差、连续光（LL）和声音暴露。声音的振动实验，使用振动模块系统，将扬声器振动直接传递到多孔板。斑马鱼幼虫暴露在交替的声音/振动中。声音被选择以确保不规则的振动模式，只有轻微的振幅变化。因此，习惯的影响以及偶尔的过度可以最小化。对声音的强度进行了调整，避免视觉上的振动。

 

行为分析：每一个透明的6孔板充满了胚胎培养基 和10条斑马鱼幼虫。选择样本大小以尽量减少动物数量，但仍能发现显著差异并保证动物福利（群体行为）。6孔培养板中加入一个温度控制的自动观测系统。适用于昼夜周期模拟的可控白光光源和具有高图像清晰度的红外高灵敏度相机，可用于监测7天内的自发活动。每天喂两次幼虫，并在喂食前一天刷新一次。为了避免介质交换干扰信号，这是在观测系统之外进行的。通过监测时间建立了每孔活动曲线，在一个孔内所有的幼虫在10分钟内活动（运动阈值7厘米/秒）。因此，每个实验组的数据由10个幼虫产生的6条活动曲线组成。对于每一个活动曲线，第九个观测日的最大活动值被设定为100%，排除个体变化。总活度是通过计算活度曲线以下的面积来确定的。在喂食和开灯之后，每次刺激事件都会读出刺激（以整个实验周期为基础的刺激的最大反应）和潜伏期（在刺激后达到最大活动的时间，分钟）。为了提高实验组之间的相似性，激励值被相关的延迟值划分。对每个刺激事件计算得到激发率，并将实验期间的平均值与对照值进行比较，以作为刺激引起的低或多动的指标。

 

结果：对照条件：在对照条件下，幼虫的静止期与暗周期相关，可见明显的明暗模式。在7天的整个观察期内，每天的活动规律不变化。我们计算了总的活动和观察在黑暗周期中活动水平非常低（5%的白天活动）。在开灯后2h和喂养后1小时达到光周期的最大活性，，并稳步下降，直到光阶段结束。灯关掉后，活性迅速下降，直至达到静息水平。在黑暗期，当食物被给予时，活性水平保持不变，在短时间内活性增加。在光照或黑暗时期，对摄食的反应是相同的。为确认饲养在黑暗的周期的反应不仅是由于机械刺激，我们增加了食品空白介质。斑马鱼幼虫对添加空白培养基没有显著反应。当灯打开时，观察到最强的活性反应。

 

光/暗周期节律改变：在时差条件下，斑马鱼幼虫仍然表现出明显的昼夜活动模式，但与对照组相比在光周期中活动较少，总活性降低。此外，在光照和暗周期喂养时，兴奋率也降低了。在对照条件下，幼虫在熄灯后10分钟内活动减少。通过在时差条件中改变光/暗开关的时间，幼虫对灯光的响应时间推迟了（超过10分钟）。对照条件下幼虫在光点关闭时，第一个数据点的活性显著下降，而幼虫在时差条件下则不是这样。在光照阶段达到最大活动的时间与光照的时间无关，但与摄食时间有关。当达到最大活性时，活性逐渐下降，直至接近对照幼虫的光阶段结束。

 

食物热量含量的改变：高胆固醇喂养的幼虫在光周期呈持续高活性水平和在暗周期活动水平显著升高。因此，与其他监测组相比，总活性最高。光照后的兴奋率增加，但摄食后不增加。为了更深入地了解活性变化的发展，进行了一项实验，从5个DPF（喂食开始前1天）监测幼虫，直到10 DPF。用重复测量方差分析对治疗与发育时间的差异进行分析。对照幼虫在5至8 DPF的光照阶段表现出明显的活性增加，从8dpf直到10 DPF无明显增加。在光照阶段，对照组和高胆固醇组无显著差异。在黑暗期，对照组幼虫的活动有轻微的显著变化。

 

连续振动：暴露于声音/振动降低了总的活动水平，特别是在光周期中，但在光周期中的活动仍高于黑暗时期。此外，夜间进食和开灯后的兴奋率也降低了。在声音/振动实验中，观察到存活率下降，而对照组无影响。因此，只有实验的前5天才能用于数据分析。