摘要：二乙基亚硝胺（DEN）存在于食物，水和日常用品中，具有毒性致癌性。迄今为止，DEN的发育毒性还鲜有报道。在这项研究中，斑马鱼在受精后6h暴露于不同浓度的DEN中来探求该化合物的胚胎毒性。结果表明，DEN对孵化率、心跳、体长和自发运动产生负效应。在暴露期间发生畸形，包括脊索畸形、心包水肿，胚胎膜混浊，尾部发育不良，卵黄囊畸形和生长发育迟缓。此外，活性氧（ROS）的产生在DEN使用后显著增加。然后，观察到氧化应激相关基因表达水平的改变。据我们所知，这是首次研究DEN对斑马鱼的影响。根据我们的研究资料，推测DEN的发育毒性与过度氧化应激有关。

 

 

简介：亚硝胺（NAs）众所周知具有很强的致癌性。稳定的亚硝胺主要来自二胺，由杀虫剂、除草剂和氮肥产生。对各种物质中NAs含量进行精确定量的技术也受到高度关注。然而， Nas对幼龄动物的发育毒性却鲜有文献记载。目前，农药、除草剂、氮肥在农业中的广泛应用，造成了农药的过量生产，不可避免地威胁着水生生物的生存。因此，有必要对NAs在发育过程中的毒性进行评价。斑马鱼，有前途的生物模型，具有体积小、寿命短、重复性好、胚胎透明等特点。此外，它经济，易于饲养。更引人注目的是，斑马鱼与人类有许多相似的特性。因此，科学家们通过长期的DEN干扰在斑马鱼体内建立了肝脏和胰腺癌模型。本实验采用斑马鱼暴露于不同浓度的DEN，观察孵化率、死亡率、畸形率、体长、心率、自发运动等生理参数。同时测定了活性氧（ROS）的产生。最后对编码抗氧化蛋白包括超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶基因（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）进行检测与分析。总之，本研究旨在为DEN的发育毒性提供新的认识。

 

斑马鱼胚胎的维持：受精后6h的斑马鱼胚胎放置到一块纱布上，使用E3培养基冲洗杂质（E3培养基：水中溶有5 mmol/L 氯化钠，0.17 mmol/L 氯化钾、0.16 mmol/L硫酸镁和0.40 mmol/L氯化钙，然后用气泵充气半小时，以保证胚胎发育的足够空气）。然后，将斑马鱼胚胎放入培养皿中。筛选健康受精胚胎体视显微镜下观察。过滤后，放置在24孔板，最终每孔2ml。标准条件下饲养（T=26±1°C、14 h/10 h光/暗周期）。

 

DEN暴露：我们将斑马鱼胚胎暴露于一系列浓度（50, 100, 150，200μg / ml）中。在E3介质中制备1mg/ml DEN原液，然后保存在4°C。对照组暴露于E3培养液。每组测量60个胚胎，三个平行对照。受精后6h的健康胚胎转移到24孔板的测试溶液中，每孔2ml，每天更换三分之一的溶液来清除代谢产物。

 

致死率、孵化率和致畸性：暴露后24、48和72h计算其致死率、孵化率和致畸性研究其发育毒性。死亡的迹象是显微镜下没有心跳。当幼虫的头或尾从胚胎膜中脱落时，孵化成功。采用显微图像采集系统对各阶段的致畸图像进行采集。致死率、孵化率和致畸性计算公式如下：致死率（%）=死亡个数/总暴露个数×100%；孵化率（%）=孵化数/总存活胚胎数×100%；异常率（%）=异常数/总存活数×100%；及时清除死亡胚胎。

 

幼虫体长：在72小时时，每组随机选取十名正常幼虫放在载玻片上。三卡因麻醉条件下，用软毛刷将幼虫刷下来。然后，利用显微图像采集系统，根据描述的方法测量体长。

 

幼虫心率：斑马鱼的心脏位于卵黄囊前和颌后。正常的斑马鱼心率很容易随着心跳识别。受精后72h，在适宜的温度，体视显微镜下对斑马鱼心率进行测量。每组选择十只幼虫，记录三次心率，计算平均值。

 

自发运动：自发运动是在胚胎期以尾部摆动为特征的肌肉收缩。从受精后23-30h开始采集数据，精确的计算，我们记录所有的斑马鱼总的自发运动。在每一个时间点，计算了1分钟，两个研究人员重复了三次，然后转换成平均值。

 

活性氧的测量：斑马鱼暴露于DEN后测量ROS含量。在受精后72小时，每组10条幼虫用冷PBS（pH 7.4）洗涤两次。制备冷的缓冲液（1mM氯化镁，0.5mM苯甲基磺酰氟（PMSF），0.32mM蔗糖，20Mm HEPES，PH 7.4）用于组织匀浆。匀浆离心（15000×g，4°C，20min）和取20μL上清液加入96孔板中，27°C培养5分钟。之后，添加DCFH-DA原液和PBS到每孔中，并在37°C 孵育30分钟。使用酶标仪在485和530nm波长条件下测量。

 

基因表达分析：经暴露处理后，正常形态的幼虫经冷的PBS冲洗两次。从每组15个幼虫中提取总RNA，使用1ul总RNA进行反转录。

 

结果：致死率：在24, 48和72 HPF三个时间点对斑马鱼胚胎或幼虫的致死率进行检测。DEN引起的死亡率存在浓度依赖性。与对照组相比，100μg／ml以下的DEN浓度组无显著性差异。但可以肯定的是，在三个时间点的浓度为150和200μg / ml时，观察到了显著的差异。

 

孵化率：斑马鱼胚胎在受精后48h开始孵化，并在72h孵化完成。对照组与低浓度（50和100μg／ml）组之间的孵化率无显著差异。在较高的组（150和200μg / ml）孵化率减少。受精后48h，暴露于在200μg/mL 的DEN浓度下孵化率显著降低。受精后72h，暴露于150和200μg/mL 的DEN浓度中观察到孵化抑制。

 

致畸性：在DEN刺激下观察到一系列形态学变化，包括脊柱弯曲、心包水肿、胚胎膜混浊、尾部发育不全、卵黄囊畸形和生长迟缓。致畸率以剂量依赖的方式增加。与对照组比较，在150和200μg／ml时较早出现畸形。此外，最突出的畸形是脊柱弯曲和心包水肿，其中形态改变，心包肿胀现象总是出现较早。

 

幼虫体长：显然，身体长度和浓度之间存在负相关。斑马鱼体长在50和100μg／ml之间无显著差异。与对照组相比，浓度分别为150和200μg／ml时，有明显的抑制作用。

 

幼虫心率：同样，幼虫的心率与DEN水平呈负相关。正常的幼虫的心跳大约是155次/分钟。所有暴露组表现出较慢的心跳， 150和200μg/ml出现显著异常心率约110次/ min。

 

自发运动：在24-30 hpf时期，胚胎的自发运动继续随时间下降。与对照组相比，在150和200μg／ml组的各时间点均可观察到明显的频率升高。在受精后23-28h，100ug/ml也能观察到明显的自发运动。

 

活性氧的测量：在100μg／ml和较高组的活性氧含量显著升高。50μg／ml组与对照组相比，ROS浓度无明显变化。

 

基因表达分析：检测了三个参与氧化应激反应的基因的mrna表达水平。与对照组相比，100μg/kg组基因CAT和SOD的转录水平显著升高，在高浓度组中逐渐下降。GPX表达量只有在DEN最高浓度时显著增加（200μg／ml），在其他浓度无明显变化。

 

结论： DEN对斑马鱼胚胎和幼鱼的发育是有害的。它对孵化率、心率、体长、自发运动等几个发育参数产生了负面影响。它引起的各种身体部位如卵黄囊、心包、尾、脊索，胚胎膜畸形。DEN暴露后，ROS水平受到影响，抗氧化酶基因表达发生变化。总之，DEN的发育毒性在一定程度上与过度氧化应激有关。