摘要：发展改进、创新的模型用于检测化妆品中的化学成分、化学品或药物的毒性对将新产品及时安全高效地推向市场是至关重要的。此外，改进毒性检测模型可以减少意外的上市后毒性的发生率，减少或消除动物试验的需要。必须保证药品、化学品或化妆品新产品的安全性，因此需要对毒理学特性进行评估。公认的方法是采用动物实验。减少，优化，并取代动物试验、体外模型创新的器官已经出现。这种模型不同层次复杂性各异，从简单的，自我组织的三维（3D）细胞培养到更先进的基于支架的多个细胞类型组成的共培养。本综述概述了毒性试验的最新进展，包括三种主要器官类型：心脏、皮肤和肝脏的体外模型。该综述还审查了欧洲和英国等对模型的监管，并总结了最佳做法，以促进接受和适当使用先进的体外模型。

 

 

简介：当开发新型药物、化学品或个人护理产品时，工业界必须评估其使用对人类健康造成的风险。因此，必须向管理局提供这些物质的性质、安全试验结果、风险评估以及适当控制风险的适当措施。强制性的注册和营销批准，以及批准的临床试验药物或个人护理产品。传统上，这种风险评估是基于在动物身上进行的安全测试，并假设动物对这些试验的反应与人类相似。虽然动物代表着系统的生物体，在生理和功能上与人类有着明显的相似之处，但也存在一些局限性。动物试验是劳动密集、费时、昂贵、伦理上具有挑战性的，不适合处理化学工业生产的大量物质或制药工业中的药物筛选过程。此外，已知物种的变异依赖于单一物种的试验，不足以批准人类的临床试验。这就是为什么药品监管部门要求在两物种动物体内测试，常用的啮齿类动物如大鼠、小鼠和非啮齿类动物如猪、狗，或食蟹猴。几十年来，动物试验一直是一个有争议的话题，自十九世纪以来就出现了有组织的反对。在体外试验中验证光毒性，细胞毒性，遗传毒性和心律失常已经建立在检测细胞DNA损伤以及心脏离子通道的抑制作用。这些测试是基于简单的细胞培养系统，采用哺乳动物细胞进行光和细胞毒性筛选。细菌和哺乳动物细胞进行Ames致突变试验和体外微核试验（MNT），检测表达人类HERG基因细胞系进行心脏安全性监测。体外试验和动物试验对急性和重度毒性的检测和慢性毒性试验有一定的效果。然而，这些测试仍然具有局限性，因为由于出乎意料的毒性约?1/3的候选药物在临床试验中失败。许多失败可以归因于心血管和肝脏毒性。典范案例是抗病毒药物非阿尿苷1992临床试验中，不可预见的毒性导致第三个病人由于乳酸性酸中毒引起的肝衰竭死亡。剩下的两个病人需要肝移植。这种毒性是非常相关的，因为它在人类中并不罕见，并且证明了临床前研究的预测局限性。最近的例子包括TGN1412的审判，尽管动物研究使用的新型免疫调节抗体CD28"superagonist"和使用低于500倍剂量对动物是安全的，但人的临床均失败。动物研究并不能预测到人一期临床的脂肪酸酰胺水解酶抑制剂BIA 10-2474毒性，其中五名患者神经系统损伤，第六人死亡。这些失败可能是由于在适当的实验动物和人类之间的进化距离的预测能力缺乏以及体外试验与体内环境的差异。动物对人类的毒性没有充分的预测，传统的二维（2D）细胞单层的体外试验既不是生理的，也不是系统的。三维（3D）细胞培养和体外模型的器官是缩小传统二维细胞培养模型与体内环境之间的差距的一种方法。三维培养产生具有生理相关属性的细胞如细胞极化，细胞或细胞-微环境相互作用，管腔形成，增殖减少，分化增加，以及RNA和蛋白表达的多种变化。因此，这些模型有望更好地代表真实组织的组织学和生理复杂性，以研究产品开发和生命周期管理中的毒理效应。自2013以来，欧盟全面禁止化妆品动物试验，因此创新型化妆品的需求变得尤为迫切。在这篇综述中，我们将讨论目前正在使用或最近开发的创新的体外模型，以及药品、化学物或化妆品行业毒理学安全评估的监管视角，为今后的发展提出建议。

 

 

监管：动物试验和二维体外系统的局限性表明，需要更好的模型，可以被监管机构接受。例如，欧盟禁止对动物进行动物试验，荷兰政府在2025之前逐步取消使用实验动物进行安全测试，这就要求监管部门接受替代方法。替代细胞培养方法已经出现在工业界进行复合筛选之前。监管接受的第一个方面是法律框架是否允许替代方法。欧洲11个欧洲监管框架对欧洲市场上的化学物质的评价和承认提出了毒理学数据要求。对这些框架的分析显示，尽管大多数框架都将某些动物试验作为提供某些毒理学信息的标准（例如，重复剂量毒性），但除此之外，所有的框架都明确规定使用其他方法获取这些信息。例外的是兽医药物产品的框架，这种可能性的法律地位尚不清楚，因为这只是在不具约束力的准则中规定的。总之，在一个新的化学实体的安全评估中，没有任何法律障碍可以省略动物安全测试。免疫扩散带来的争论提出了自己的生物只能绑定与人类细胞和相关的动物模型安全评价是不可用的，在这种情况下，动物试验毫无价值。因此，得出的结论是，对人类细胞和人体组织进行广泛的测试是足够的，对非相关物种的毒性研究可能是误导性的，并且是令人沮丧的，符合国际监管指南ICH主题S6：生物技术衍生药物的临床前安全性评价一致性。替代模型的应用是令人鼓舞的，但提出了一个问题，为什么动物测试的安全评价尚未被取代。主要原因是缺乏科学的可接受和与生理有关的动物安全试验替代品。在批准之前，必须进行彻底的验证，最好是在经合组织内部接受，以便在全球范围内实现相互承认数据。   替代测试的验证是测试的可靠性和相关性的过程，为某一特定目的而设立的。在过去的几十年里，欧洲替代方法验证中心（ECVAM），与国际专家的合作，设立了准则的验证。对测试的有效性评估提出了七个模块：测试定义（科学目的和机械基础）、实验室内可变性、可转移性、实验室间变异性、预测能力、适用域和性能标准。 

 

目前最先进的模型：心脏：心脏毒性是药物失败的主要原因和实质性的安全问题。可以通过抑制hERG通道数据和心电周期QTc间期的测量准确地预测心脏毒性的某些方面如长QT综合征和心律失常。这使得结构性心脏毒性（即直接破坏组织）得到解决。结构作用的机制却知之甚少，目前的体外模型不能将其复制到一个可接受的标准。因此，体外心脏模型的改进是必要的。反复出现的主题之间的器官模型是二维培养的永生细胞株和原代细胞去分化的生理相关性的不足。干细胞来源的心肌细胞（SC- CMS）是一种比较新颖的模式，有助于克服个体间及种间变异和能够捕捉到的供体细胞的表型，提供优势的永生细胞株代表只有一个单一的供体的表型。SC -CMS最近已被证明在预测阿霉素引起的心脏毒性的严重程度和识别潜在的药理学机制是准确的。三维心脏模型显示细胞活力，结构和功能增强。在开发三维模型时，应考虑细胞的起源和组成；在体内，心肌组织由30%个心肌细胞和70%个非心肌细胞组成（NMCs，主要是内皮细胞和成纤维细胞）。这些非心肌结构和功能是重要的，以及在开发药物引起的心血管损伤。三维模型结合心肌细胞和NMCs被证明是功能优于二维模型，模型的钙稳态失衡，线粒体瓦解，和细胞存活率下降。心脏毒性的微流控模式正在发展，他们希望通过血管形成和结构，目前未能在其他模型建模提高生理相关性。近日，首个3D打印植入芯片的心脏具有集成传感系统的非侵入性的电子读数产品并成功地应用于研究药物反应。

 

皮肤：皮肤是高度免疫活性的屏障，对药物和化学物质的吸收非常重要，因此对皮肤毒性的评估非常重要。有几种方法来模拟人体皮肤的复杂性。最常用的人角质形成细胞的二维单层膜模型，通常用于临床前检查。二维单层模型没有模拟皮肤结构方面如角化皮肤结构和不能模拟屏障功能和免疫途径。复杂的模型，如人体表皮（RHE）模型，从主细胞形成三维器官模型能够形成良好的复层上皮的代谢和屏障功能。有几种市售的模型已被验证，作为替代动物试验评估皮肤腐蚀和皮肤刺激。一些研究表明，这个模型在变应性致敏物质鉴定方面优于传统的二维培养和模拟表皮层免疫。然而，人类的皮肤有好几层组成，而这种复杂性未能解决。因此，可以概括这种复杂的模型是必需的。全层模型（FTMS）是由表皮及真皮浅层组成。表皮层是可比的，真皮层含有分布在胶原基质中的真皮真皮成纤维细胞。研究调查了全层模型包括黑素细胞和MUTZ-朗格汉斯细胞，显示改善模型的敏感性和还包含其他类型的细胞，内皮细胞和毛囊。除了多种细胞类型外，细胞分化的程度和其他皮肤成分（如基底膜）也很重要。建立一个适合长期培养的具有持续角质层能力的皮肤模型是具有挑战性的，但对于亚急性和慢性毒性试验是有用的。芯片微系统实验室表现出延长的培养时间和稳定的细胞功能在可控的微环境中，并与其他器官的联系。然而，他们的预测和验证，有待评估，应进一步研究。

 

肝脏：肝毒性是工业界的一个重要安全问题。药物或化学品的一过性引起外源化学物代谢酶在肝脏中高表达。这可能产生化学反应代谢物除了母体化合物，这两者都可能导致毒性，制备肝毒性复合物精确模型。因此，代谢能力是一个有效的肝毒性模型的关键要求，目前还没有实现。即肝脏毒性是临床试验中安全失败的主要原因之一。一个可靠的体外肝毒性模型应该类似于体内表型，也适合于长期研究和高通量筛选应用。人原代肝细胞（HPH）是肝脏体外模型的黄金标准，但在某些方面受到阻碍：稀缺性，因为HPH只能来自手术废弃组织或尸体的肝脏。个体差异，如果每个供体细胞数量有限且寿命有限，则可能妨碍重复研究。去分化，成熟细胞表型在标准细胞培养条件下的丢失。此外，HPH不易体外扩增。肝细胞系HepG2和HepaRG细胞是可行的，但代谢能力有限。近年来，蛋白质组学的研究应用，HepG2，HepaRG，和upcytes透露HepaRG细胞同人原代肝细胞有最相似的蛋白质。肝毒性预测能力的评估，HepG2细胞是继HPH后最具预测性。这些结果表明，最常用的肝模型在体外完全肝毒性实验中是不满意的。干细胞来源的肝细胞样细胞（SC -HLCS）是另一个新兴的模式，但目前显示肝脏表型不成熟。三维培养技术如球体培养常常显示出增强的表型，具有优越的敏感性和特异性。自发形成球状体在适当的条件下，可以由现存的大多数肝脏模型制成。他们很可能将成为未来肝毒性试验的基石。3D生物打印不使用支架可以重现高度组织的肝结构，迅速形成紧密连接，细胞外基质产生的固体微组织可以模拟复杂的肝毒性，包括纤维化。类似于本文所述的其他器官，微流体装置正在开发中，这些可能在将来证明是一个富有成果的研究途径。

 

创新毒性模型发展：数学建模可以提供一个替代的和互补的安全评估平台，增加机械的理解，硅片测试假设，预测定量结果，并有助于优化，设计和解释创新的体外模型。定量建模在药物分类和特性方面的应用使数学成为药物发现的重要工具，被视为毒性试验进展的一个组成部分。这些定量的数学模型或硅片建模，现在也被广泛使用作为临床前药物开发过程的一部分。数学模型已被用来识别药物代谢过程中的关键参数，如扑热息痛，通过数值、灵敏度和时间尺度分析以及确定临界剂量阈值。这说明模型可以用来优化体外设计确保相关的给药方案进行了研究和实验模型被用于适当的代谢酶的表达具有生理相关性。

 

模型之间的共同主题：在体外模型中有共同的主题，这可能有助于促进他们的科学接受和使用。例如，一个细胞模型应该包括细胞类型的最小数目的体内生理准确概括。添加更多的细胞类型会降低重复性，增加成本和测试失败，并导致不必要的干扰测试结果。然而，包含多种细胞类型，或组织蠕动运动等特征，会影响组织对毒物的反应。可提高预测的准确性。测试所需的准确度，以及系统的复杂程度，取决于风险评估或药物开发过程中的问题和阶段。在早期阶段，降低精度有利于降低成本是可以接受的，更简单的模型可能是合适的。

 

表型：确定一个问题的体外模型，特别是确定适当的复杂性是很有挑战性的；适当表型的先进模型可以帮助做出明智的决定。这种表型的先进模型已经在肝脏，皮肤和心脏完成。例如，在2D和3D的球体培养应用蛋白质组进行分析。2D培养在16小时内形成了显著改变的蛋白表达模式。而3D培养连续7天维持类似于HPH的表达。这一发现表明3D培养物在2D以上具有更强的生理相关性，表明在早期分离原代细胞后能更好地识别毒物。

 

3D培养支架：另一个共同的主题是在先进的体外模型中使用支架来支持三维组织结构。水凝胶是一种由水、细胞外基质（ECM）蛋白和模拟体内ECM的生长因子组成的支架。有各种各样的水凝胶产品，自然和合成的。合成水凝胶是明确定义的，具有小批量变化，可以适应直接功能。支架也可能以固体材料，为组织提供机械支撑的形式。生物材料的主要优点是生物相容性和柔韧性，而合成材料的优点是相容性和可控性。合成的支架可以用规定的孔隙率、厚度和刚度来制作，用于预期的组织和测试。细胞可以感受到基质的硬度，这可能会影响细胞粘连的类型、细胞骨架结构、细胞增殖等因素。所有支架常见的缺点包括可视化和分析单个细胞，它们并不适用于所有细胞。

 

无支架三维模型：球体是一个例子，一个自发形成的无支架模型，当贴壁细胞悬浮。无支架系统不存在脚手架的缺点，例如测试材料的结合、批处理和批处理的可变性以及脚手架运输或扩散的阻抗。然而，流体流动和剪切应力难以融入缺乏锚定支架的培养物中。

 

结论：皮肤、肝脏和心脏3D模型已经显示传统2D毒性测试方法的附加价值。需要对现有模型进行更多更好的描述，在不同的变体中，并与较少或更复杂的模型进行比较，以充分了解它们的最佳部署位置。新模型的特征化的新方法应该是标准化的，与金标准的比较并不总是可能的，也不适合于新模型，它们的正确处理可能具有挑战性。