摘要：肺炎链球菌是细菌性脑膜炎最重要的原因之一，由细菌和宿主毒素驱动的感染。在这项研究中，我们开发了斑马鱼胚胎肺炎球菌脑膜炎模型，以便对早期宿主微生物相互作用进行实时观查。

方法：斑马鱼胚胎在尾静脉或后脑脑室注射绿色荧光野生型肺炎链球菌D39或肺炎链球菌突变体。kdrl：mCherry的转基因斑马鱼线血管可视化， anti-L-plastin染色后能观察到吞噬细胞。MPX：GFP / MPEG1：mCherry斑马鱼，有绿色荧光中性粒细胞和红色荧光巨噬细胞。采用荧光共焦显微镜和延时显微镜进行成像。

结果：尾静脉感染后，我们看到局灶性血管中的肺炎球菌堵塞，细菌通过血脑屏障进入蛛网膜下腔和脑组织。同野生型肺炎链球菌相比，后脑脑室感染肺炎链球菌突变体显示生长衰减和在脑内迁移。共焦成像显示最初在蛛网膜下腔对肺炎链球菌的天然免疫反应主要由嗜中性粒细胞组成，肺炎链球菌溶血素介导的杀伤活性，引起吞噬细胞明显减少。

结论：这种新的脑膜炎模型允许实时分析和可视化肺炎球菌脑膜炎的宿主-微生物相互作用。对进一步深入了解肺炎球菌脑膜炎的发病机制是一个非常有前途的工具。

关键词：肺炎球菌脑膜炎  肺炎链球菌溶血素  活细胞成像  肺炎链球菌  斑马鱼  宿主-微生物相互作用

背景：肺炎链球菌是产生严重感染的主要原因，如败血症、肺炎和脑膜炎。尽管肺炎球菌疫苗和有效的抗菌治疗取得了进展，但侵袭性肺炎球菌疾病的疾病负担仍然很高，特别是在资源贫乏的国家。肺炎球菌性脑膜炎是儿童和成人的严重细菌性脑膜炎。肺炎球菌脑膜炎的易感性和严重程度由宿主和病原体特征决定。免疫状态和破坏大脑的自然屏障是公认的影响宿主易感性的因素。近年来，宿主的遗传构成越来越受到人们的重视，例如，由于先天免疫受体（Toll样受体4）、Fcγ（Fcγ）受体和补体系统的遗传变异，决定了其易感性，其中最重要的是多糖胶囊，有超过90种不同的血清型。不同血清型的带菌率和侵袭力不同。其他重要的毒力因子，包括细胞毒素溶血素和几个细胞表面蛋白，如肺炎链球菌表面蛋白A（PSPA）。细菌与宿主的关系驱动肺炎球菌基因组变异。基因区域的存在和缺失，以及核心基因组中的单核苷酸变异都能增加病原体引起疾病和影响疾病严重程度的能力。为了研究肺炎球菌毒力，已经建立了不同的实验小鼠模型。这些小鼠模型的局限性包括伦理问题、实验所需的高成本和时间；这些限制使小鼠不适合大规模筛选。斑马鱼（Danio rerio）已经成为一个研究的人类病原体或其相关动物病原体引起的感染性疾病的重要模式生物。斑马鱼是一种先天和适应性免疫系统类似于人体免疫系统的硬骨鱼。先天免疫系统在斑马鱼胚胎发育的早期阶段已经活跃，而适应性免疫系统在受精后4 - 6周活跃。该模型的另一个优点是由于斑马鱼胚胎的透明性和广泛的荧光工具，能够实时研究宿主与病原体之间的相互作用。其他的优点包括斑马鱼的高繁殖力、胚胎的外部发育以及基因编辑工具和基因表达工具的可用性。此外，该模型可用于中等容量筛选，以识别具有毒力改变或中等介质筛选的细菌突变体。最近，该模型已被应用于可视化和研究结核分枝杆菌脑膜炎--一种中枢神经系统传染病。此外，已经证明斑马鱼胚胎和成年斑马鱼易受肺炎球菌感染并产生脑膜炎。研究目的是建立一种允许肺炎球菌病原体相互作用的实时分析的斑马鱼胚胎感染肺炎球菌脑膜炎模型。感染的可视化是利用转基因鱼（kdrl：mCherry）有红色荧光血管，结合荧光远红染色与荧光标记的anti-l-plastin吞噬细胞。在一个双标记的MPX：GFP / MPEG1：mCherry中更详细地进行了研究斑马鱼吞噬细胞动力学，有绿色荧光中性粒细胞和红色荧光巨噬细胞。

方法：细菌菌株及生长条件：用肺炎链球菌血清型2型野生株D39和溶血素缺失突变株. 肺炎球菌菌株生长在含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂平板，培养条件37°C，5%的CO2。肺炎球菌菌株标记HLPA-GFP是致命，已被用于在体外和体内成像。在4.5μg/kg氯霉素的培养基上筛选转化子。细菌过夜培养后，收集悬浮在添加0.5%的酵母提取物的Todd Hewitt液中，在37°C.生长到对数中期。收集细菌，离心（6000转/分，10分钟），用无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗（PBS），悬浮于含20%甘油的PBS以获得所需浓度和储存在?80°C。注射前，细菌悬浮于无菌0.5%（w／v）酚红溶液中，有助于注射过程可视化。

斑马鱼饲养、胚胎护理和注射操作：（kdrl：mCherry野生型斑马鱼血管内皮细胞表达红色荧光；MPEG1：mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和红色吞噬细胞，生长在26度，通氧，10/14h的光暗循环环境中。受精后1h收集斑马鱼胚胎，在28度添加0.3 mg/L亚甲基蓝E3培养基中培养添加0.003%的PTU，抑制黑素细胞的形成。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾静脉单独注射1 nL肺炎链球菌。

受感染斑马鱼胚胎的存活试验：感染病毒后，突变的斑马鱼胚胎，28°C培养在6孔板中，每组一孔，每孔20个胚胎。在注射后12和120小时之间确定了死亡率（HPI），通过在固定的时间点监测活的和死的胚胎，所有的实验都进行了3个平行试验。

斑马鱼胚胎的荧光成像:使用荧光显微镜对HLPA- GFP肺炎链球菌感染和非感染斑马鱼胚胎进行影像学筛选。未受感染的对照斑马鱼胚胎和感染后可见荧光细菌的胚胎在先前确定的时间点被选定。4%多聚甲醛固定液固定过夜。随后，胚胎被存储在?20°C的100%甲醇中待用。

斑马鱼胚胎的时间推移荧光成像：图像连续在2.5h内间隔一分钟获取。将胚胎包埋在溶解于人工盐水的1.5%低熔点琼脂糖中，使其恒定保持在28度。

免疫组织化学染色：anti-l-plastin染色斑马鱼胚胎吞噬细胞。冷冻胚胎解冻后，经PBTX冲洗后，0.24%胰蛋白酶浸润，含10%正常山羊血清（NGS）的1% PbTx封闭3h，减少非特异性的抗体结合。anti-l-plastin（1:500 v/v稀释）抗体缓冲液（1%（v/v）和1%（W/V）牛血清白蛋白（BSA）室温下孵育过夜。PBTX冲洗后同封闭液孵育1h。胚胎同山羊抗兔二抗孵育过夜。

组织病理学分析：三卡因麻醉斑马鱼胚胎，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，4微米厚。Nissl染色，并对染色切片进行观察。

结果：后脑脑室和尾静脉注射肺炎链球菌引起斑马鱼胚胎暴发性、剂量依赖性感染：后脑脑室感染：探讨肺炎链球菌可引起斑马鱼胚胎的脑膜炎，我们直接在后脑脑室注射细菌，感染呈剂量依赖性，高剂量细菌导致发病早，死亡率高。注射100CFU的存活率为88%，注射300CFU的存活率为25%，注射600CFU的存活率为5%。

全身性感染：加大剂量尾静脉注射肺炎球菌导致剂量依赖性感染。100CFU /胚胎，300 CFU /胚胎和600 CFU /胚胎的平均存活率分别为0。相比于后脑脑室注射，尾静脉注射能更快速的导致疾病发展。在整个斑马鱼体内和中枢神经系统都观察到细菌浸润。组织学分析表明，细菌早在12 HPI出现在脑实质。斑马鱼胚胎中肺炎球菌性脑膜炎最初的先天免疫反应主要由中性粒细胞组成。

结论：已经开发出了一种新的可视化斑马鱼胚胎感染模型。该模型有助于我们对细菌性毒力因子和宿主防御机制在肺炎球菌脑膜炎发病机制中相互作用的理解。此外，我们观察针对肺炎链球菌的靶向直接细菌毒性，防止肺炎球菌性脑膜炎宿主来源的毒素介导的脑损伤和相关疾病。