摘要：神经生长因子（NGF）不仅是神经生长的重要因素，也是引起炎症的主要因素。据报道，抑制NGF可减轻几种动物模型的多种疼痛。本研究旨在阐明NGF抗体在小鼠膝骨性关节炎（OA）疼痛模型中的作用。

 

方法：采用六周龄的雄性C57BR / J小鼠（n = 30）。对照组十只小鼠，右膝关节接受生理盐水注射；另20只为实验组，右侧膝关节注射MIA。术后三周，20只实验小鼠随机分两组。非治疗组：10毫克/公斤，无菌生理盐水腹腔注射或抗NGF抗体（抗NGF组：10 mg/kg，i.p.）。所有小鼠接受FG神经示踪剂到右膝关节。在一项行为研究中，我们在术前、术后3周（治疗前）、术后4周（治疗后一周）和术后5周（治疗后2周）使用步态定量步态分析系统评估步态。术后5周（治疗后2周）从L4-L6切除背根神经节（DRG）进行免疫组化分析。检测降钙素基因相关肽（CGRP），计录FG标记或DRG神经元CGRP免疫反应数量。

 

结果：在步态系统分析中，非治疗组与对照组相比，占空比、摆动速度和打印面积均下降。抗NGF组与非治疗组比较有显著性差异。非治疗组与对照组比较， DRGs的CGRP表达上调，抗NGF组与非治疗组相比有显著性差异。

 

结论：MIA注入膝关节内诱导步态障碍，膝骨关节炎疼痛小鼠模型DRG神经元CGRP表达上调。腹腔注射抗NGF抗体可抑制DRG神经元的步态障碍和CGRP的上调。这些结果提示抗NGF治疗膝关节骨性关节炎可能是有价值的。

 

 

背景：膝关节骨性关节炎（OA）是一种常见的慢性退行性疾病，以关节软骨成分退变、滑膜炎、软骨下骨重塑和关节肌肉萎缩为特征。膝关节骨性关节炎患者通常伴有膝关节疼痛，采用多种治疗方法，包括药物治疗、关节腔内注射透明质酸、手术等。作为研究膝关节骨性关节炎疼痛新靶点的一部分，我们关注的是与疼痛相关的分子，包括神经生长因子（NGF）。NGF不仅在维护和发展神经系统中起着重要作用，也是产生炎症和伤害的主要原因。全身注射神经生长因子诱导热痛和机械痛敏。全身注射NGF抗体减轻神经病理性疼痛动物模型的异常性疼痛和痛觉过敏，包括神经干或脊神经结扎。膝关节骨性关节炎的基础研究已有了几种动物模型。包括前十字韧带断裂模型，该模型大鼠内侧半月板撕裂。MIA注射模型导致关节进行性损伤，某些特征可能被认为类似于OA和并有显著的疼痛相关行为。MIA注射模型优于膝关节疼痛评估模型，包括医用半月板模型在内的动物模型更好地接近了人类骨性关节炎的解剖病理。以前的报告评估疼痛相关行为用von Frey试验，为机械性评价。临床上，膝关节骨关节炎患者患膝关节疼痛，包括步态障碍但没有机械性痛觉过敏。一些作者用重量分析法评估膝关节疼痛的行为。例如，大鼠步态分析系统可以定量地评价大鼠和小鼠的步态和运动功能。这个系统最近被用来分析膝关节OA疼痛模型中受损的步态功能。关于膝关节OA疼痛的病理机制，以前的免疫组化分析表明，膝OA疼痛模型中感觉神经系统中疼痛相关分子的表达增加。这一发现证明疼痛状态下感觉神经系统中与疼痛相关分子的上调。假设抗NGF治疗膝关节骨性关节炎小鼠膝关节疼痛是有效的。本研究的目的是利用步态分析系统和免疫组织化学分析法评价NGF抗体在膝关节OA疼痛模型中的作用。

 

方法：膝骨性关节炎疼痛模型：30周龄的雄性C57BL／6小鼠。（对照组：n = 10; MIA没有治疗（非治疗组）：n = 10;MIA+抗NGF治疗（抗NGF）组：n = 10）.实验过程中动物用戊巴比妥钠麻醉（40毫克/公斤，腹腔注射）。非治疗组和抗NGF组，右膝关节单次注射含0.2mg MIA的10ul生理盐水。通过髌韧带采用27G针头90度角在膝盖注射。术后三周，小鼠随机分为两治疗组接受无菌生理盐水（10毫克/公斤，腹腔注射）（非治疗组）或抗NGF抗体（10毫克/公斤，腹腔注射）（抗NGF组）。先前已证实了这种药物治疗神经性疼痛的疗效。为检测右膝关节背根神经节（DRG）神经元，所有20只动物右膝关节腔内注射2%逆行神经元示踪剂 FG。对照组在右膝关节腔内注射10ul无菌生理盐水，三周后关节腔内注射2%逆行神经元示踪剂 FG。

 

行为评价（步态分析）: 简单地说，老鼠被放在一个位于黑暗的房间的玻璃板上，可以自由行走。荧光灯的光束通过玻璃板。光束完全内反射。当一个爪子接触到玻璃板，光束向下反射。这导致了一个鲜明的明亮图像的爪子打印。整个运行过程都是用摄像机记录的。这些数据是按照前面的描述，使用模式软件获取、压缩和分析。术前、术后3（前处理；预处理）4周或5周（治疗后1周或2周），所有小鼠均走在玻璃板3次。记录3次步态。我们比较了三组间以三变量的同侧和对侧后肢运动的比例，即占空比；摆动速度；打印区。

 

免疫组化分析：所有的程序，包括麻醉、灌注、切片、染色、观察和评价免疫阳性神经元。在所有三个组中，术后四（n = 5）或五（n = 5）周（治疗后一周或两周），小鼠用戊巴比妥钠麻醉（40毫克/公斤，腹腔注射）。0.9%生理盐水灌注，随后是4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液30ml灌注。切断L3-L5的右侧DRGs。样品4度4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，然后4°C保存在0.01 M含20%蔗糖的PBS中20小时。冷冻切片，用溶于0.01MPBS的0.3%过氧化氢溶液浸泡。使组织内过氧化物酶失活。然后在0.01M的PBS溶液中室温下处理90分钟。探讨DRGs神经肽和CGRP的表达。每组30个样品使用荧光显微镜观察。计算了含FG标记的神经元和FG标记和CGRP免疫反应的神经元数目。

 

结果：行为分析：非治疗组，与对照组比较，预处理组、治疗后1周、治疗后2周对侧占空比明显降低。与对照组相比在抗NGF组的同侧，对侧后肢占空比值仅在治疗前明显降低，此外，与非治疗组相比抗NGF组的比例显著提升。预处理，治疗后1周，治疗后2周较对照组，对侧摆动速度显著降低。与对照组相比，抗NGF组仅在治疗前显著降低。治疗后1周，较非治疗组对侧摆动速度显著提升。相比于对照组，治疗后1周、2周非治疗组、同侧和对侧打印区域的比值显著下降。抗NGF组仅在治疗前显著降低。治疗后1周、2周较非治疗组，抗NGF组显著提升。

 

免疫组化分析：相比于对照组，治疗后1周、2周非治疗组FG标记和CGRP免疫标记的神经元显著增加。与非对照组相比，抗NGF组在治疗后1周、2周CGRP表达显著降低。

 

结论：MIA注射到膝关节诱导步态障碍和小鼠膝关节骨性关节炎疼痛模型DRG神经元CGRP表达的上调。此外，腹腔注射抗NGF抗体抑制步态障碍和DRGC神经元GRP的上调。这些结果表明，抗NGF治疗膝关节骨性关节炎可能是有价值的。