摘要：急性有机磷（OP）中毒是一个世界性的临床和公共卫生问题。此外，胆碱能危象，神经退行性疾病和脑损伤是本中毒综合征严重的标志。我们产生了斑马鱼严重急性有机磷中毒的化学模型，其特征是头部形态改变和脑变性。在该模型中导致脑毒性的病理生理途径与人类相似。本研究的目的是评估这种斑马鱼模型的预测能力，选择的药物包括"标准治疗"药物（阿托品、解磷定），可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂（石杉碱甲、加兰他敏、毒扁豆碱和吡啶斯的明）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂（MK-801和美金刚胺），双重功能的NMDA受体和乙酰胆碱受体拮抗剂（美芬和胃复康）和消炎药（地塞米松、布洛芬）。幼虫暴露于4uM氧毒死蜱 [ 1×半数致死浓度（LC50）]测定药物对斑马鱼生存和幼虫头部形态异常患病率的影响。通过组织病理学和转录分析解磷定，美金刚，美芬和地塞米松的神经保护作用。我们的结果表明，斑马鱼模型的严重急性中毒具有很高的预测价值，可以用来识别新的化合物，提供神经保护，以防止严重急性中毒。

关键词：斑马鱼模型 急性重度有机磷中毒 脑毒性 神经保护作用 解毒剂

简介：有机磷（OP）化合物是乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂的一类。不仅用于农业和工业，也用作化学战神经制剂。严重急性中毒是一个世界性的临床和公共卫生问题，每年约有300万例，300000人死亡。在发展中国家，特别是来自亚洲-太平洋地区的发展中国家，主要关注的是OP农药的自我中毒。发达国家主要担心恐怖分子可能使用高毒性的OP化合物或在事故或自然灾害发生后在运输或储存设施中释放这些化合物。神经退行性变和脑损伤是严重急性OP中毒的特征。OP化合物抑制乙酰胆碱酯酶, 导致神经递质乙酰胆碱（Ach）积累在胆碱能突触间隙，随后长期激活烟碱型和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（AchR），胆碱能神经元的过度兴奋和惊厥。然后，级联下游事件发生，导致继发性神经元毒性。兴奋性氨基酸（EAA）的释放，如谷氨酸和天冬氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的激活促进细胞内Ca2 +内流，从而激活不同的脂肪酶、蛋白酶、核酸内切酶，激酶或磷酸酶和严重脑损伤的结果。活性氧的产生也可在炎性反应和细胞死亡方面发挥重要作用。斑马鱼是脊椎动物模型，越来越多地用于生物医学研究，包括人类毒理学研究。斑马鱼胚胎/幼虫的一个关键优势是适合用于药物和/或毒理学效应的化学库的体内高通量筛选。在此背景下，斑马鱼已被提议作为基于单细胞的实验和哺乳动物（和最终人类）测试之间的中间步骤。此外，以往的研究表明，斑马鱼是模拟人类神经病理过程，一个优秀的生物模型。使用氧毒死蜱（CPO）为原型的OP化合物，我们产生了斑马鱼严重急性中毒的化学模型。在大体形态水平上，斑马鱼模型的特征是头部有脑水肿，表明脑坏死。进一步的组织病理学分析证实形态学改变下存在严重的脑损伤。我们证明斑马鱼严重急性中毒模型显示许多病理生理机制，包括乙酰胆碱酯酶抑制、NMDA受体激活、钙调节紊乱和炎症和免疫反应的激活，，这在人类中毒综合征相关。暴露于CPO三小时后，显示幼虫头部形态变化的百分比和幼体表型发展的不可逆转。虽然上述数据有力地表明，该模型可能是有用的，以防止在严重急性中毒人的脑毒性，需要额外的研究，以证明模型的预测能力。本研究的目的是评估斑马鱼严重急性中毒模型的适用性，以鉴定对人类严重急性中毒的神经保护作用的新化合物。本文利用斑马鱼模型，并以4μM CPO [ 1×（半数致死浓度LC50诱导）]，评估一种常用于人类医学的药物的潜在神经保护作用。首先，设计一种治疗前的治疗方法，评估斑马鱼模型的适用性，以确定医疗对策。四可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂（石杉碱甲、加兰他敏、毒扁豆碱和吡啶斯的明），以及毒蕈碱型 AChR拮抗剂阿托品和肟解磷定，采用预处理的方法进行测试。此外，设计了一种后处理治疗方法，以评估该模型在急性重症OP中毒病例中识别具有神经保护作用的新分子的适用性。这些药物包括两NMDA受体拮抗剂（MK-801和美金刚），双功能的NMDA受体拮抗剂（AChR和美芬和胃复康）和消炎药（地塞米松、布洛芬）。测定所有化合物对斑马鱼幼虫24h存活率和异常头的患病率的影响。此外，通过组织病理学评价和三个可能参与严重急性中毒的选择基因的mRNA定量，进一步证实了保护脑的对策的有效性。研究结果表明，重症急性OP中毒的斑马鱼模型能对解毒剂在哺乳动物模型的神经保护作用提供合理准确的评价。

方法：幼虫：成年野生型斑马鱼在反渗透纯化含90ug/ml的海洋水中生长，水温27-29度。通过自然交配获得胚胎，并保存在28.5°C海水中。幼虫在实验期间未喂饲。

化学物：用二甲基亚砜制备的CPO和地塞米松存储溶液，乙醇制备布洛芬的储存溶液，人工海水制备加兰他敏，胃复康，阿托品，解磷定，石杉碱甲，美芬，毒扁豆碱，美金刚胺，吡啶斯的明和MK-801的存储液。通过稀释原液来制备暴露溶液。暴露于溶液中的溶剂的最终浓度为0.01%，除了可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂。这些化合物中只有几种能弱穿透水中斑马鱼幼虫的皮肤。将1%二甲基亚砜加入到该组化合物的曝光介质中。

重症急性中毒模型的建立：斑马鱼幼虫在受精后7天内被转移到48孔板（每孔1个幼虫）。暴露4uM CPO，在28.5℃的黑暗培养箱中24小时，这相当于1×LC50。对照幼虫在相同条件下暴露于相同浓度的载体（0.1% DMSO）。斑马鱼模型的特征是在大体形态水平上头部致密和有浑浊区。在每个实验结束时，确定头部形态变化及存活率和患病率。

治疗的方法：使用两种不同的治疗方法。预处理7-dpf斑马鱼幼虫，用不同浓度的预防性药物预处理1小时。后共同暴露在一个1×LC50 CPO和一个额外的预防性药物24h。使用这种治疗方法评估加兰他敏（0.5mM），石杉碱甲（1uM），毒扁豆碱（75uM）、吡啶斯的明（10 mM）、阿托品（0.4 mM）和氯磷定（0.4 mM）。加兰他敏，具有非常低的斑马鱼皮肤渗透率，预处理时间增加到24小时（从6到7的DPF）。在24h潜伏期结束时记录生存和形态特征。治疗后7-dpf斑马鱼幼虫第一次挑战1×LC50 CPO单独3小时，后共同暴露一个额外的21h， 1×LC50 CPO加治疗药物。选择的药物包括：解磷定（0.4mM）， 阿托品（0.4mM），MK -801（100uM），美金刚胺（50uM），美芬（25uM），胃复康（50uM），地塞米松（40nM），布洛芬（2.5uM）。在潜伏期（3小时+21小时）结束时评估头部的形态变化的存活率和患病率。

组织病理学分析：采用显微镜与标准操作。RNA的制备及荧光定量PCR分析：采用标准协议进行RNA的制备及荧光定量PCR分析。

数据分析：每个实验用相应的阴性对照（溶剂对照）和阳性对照（只有CPO）进行。两个端点：头部形态的存活与变化用百分数表示。仅CPO的百分数为100%，然后相对应的CPO处理确定所有共同暴露治疗的结果。使用IBM SPSS对数据进行t检验分析。

结果：预处理：使用预处理的治疗方法，我们探讨了四可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂（加兰他敏，石杉碱甲，毒扁豆碱和吡啶斯的明）对斑马鱼幼虫暴露于1×CPO LC50中24 h的潜在预防作用。四种药物预处理均能显著降低幼鱼死亡率和幼体形态发生率。在所有试验药物中，形态变化的减少非常相似，范围为51.9～58.5%。然而，药物在降低致死率方面存在差异。因此，毒扁豆碱提高生存到83.9%，而吡啶斯的明，石杉碱甲和加兰他敏生存增加作用比较温和。阿托品或解磷定通常给予急性OP中毒动物模型中毒不久或中毒1分钟，降低死亡率。当斑马鱼幼虫用阿托品预处理时，存活率显著增加，同时形态变化的发生率也随之降低。

治疗后：阿托品和氯磷定的保护效果也使用斑马鱼中毒模型测试。药物可以显著降低形态变化率，解磷定的效力高于阿托品。此外，解磷定处理，但不是阿托品，显著提高了幼虫的生存率。我们的下一个目标是分析靶向斑马鱼次级神经元毒性途径的药物的功效。两NMDA受体激动剂（美金刚和MK-801）和双功能的NMDA受体和AChR拮抗剂（和美芬和胃复康）使用斑马鱼模型进行后处理测试。斑马鱼幼虫暴露于每种药物单独浓度不影响死亡率或形态，除MK-801外，均导致幼虫色素沉着。能显著降低死亡率和动物头部形态变化的患病率。MK-801和美芬后处理提供最大的保护，死亡率降低63.9和60.1%。最后，使用一种甾体激素（地塞米松）和一种非甾体抗炎药（布洛芬）对严重急性中毒性斑马鱼模型进行了后处理治疗。布洛芬的保护程度高于地塞米松。

不同组织急性重症OP中毒的救治：确定对头部形态的改变的保护是否确实预示了在细胞和分子水平上的神经保护作用。约45%的幼虫暴露于1×LC50 CPO 24小时抗严重急性OP中毒。因此，很难确定在药物治疗后具有正常形态的幼虫是否是真正地被"拯救"或仅仅具有一种"抗性"。为了克服这种干扰因素，对每个幼虫的头部形态进行分析：（1）即3小时CPO暴露后治疗（2）在治疗结束。解磷定，美金刚，美芬和地塞米松，对暴露3h的急性重症OP模型表现出明显的保护作用。在暴露3小时后，选择头部形态中等变化的幼虫作为解毒剂治疗对象。当幼虫暴露于CPO额外21小时后，约40%死亡，其余60%显示头部形态改变的严重程度增加。同一幼虫脑组织病理学评价显示广泛的液化性坏死。转录分析表明钙代谢相关基因的表达上调（hspb11，pth1a）和炎症反应（IL-12）。解磷定有非常有效的神经保护作用。用这种药物治疗后，87.7%的幼虫恢复正常的头部形态。此外，未观察到严重急性中毒在组织学水平上的病变特征。解磷定也恢复了部分pth1a和IL-12水平。美金刚也抵消了CPO在约47%的幼虫头部的大体形态的影响，组织病理学评估显示，一般情况下液化性坏死。地塞米松防止约42%幼虫的液化性坏死，但地塞米松仅在三个选定基因中的两个引起显著的恢复。

结论：研究结果表明，斑马鱼严重急性中毒模型有高度预测能力，可以用于识别治疗急性中毒引起人类脑毒性的新化合物。