摘要：本研究旨在评价N-乙酰半胱氨酸酰胺（NACA）滴眼液在雄性Wistar大鼠中逆转亚硒酸钠诱导白内障形成的效果。

 

方法：将四十只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、N-乙酰半胱氨酸酰胺组、亚硒酸钠诱导的白内障组和N-乙酰半胱氨酸酰胺治疗的亚硒酸钠诱导的白内障组。在产后第10天腹腔注射亚硒酸钠，而N-乙酰半胱氨酸酰胺则在产后第9, 11，13天腹腔注射。当大鼠睁开眼睛时，在第2周末（产后第14天）评价白内障。从第3周开始，直到第4周结束（产后第15天至第30天），给予N-乙酰半胱氨酸酰胺滴眼液，并在第4周结束处死大鼠。分离和检查氧化应激参数，如谷胱甘肽、脂质过氧化和钙水平以及谷胱甘肽还原酶和巯基转移酶活性。使用晶状体蛋白的水溶性部分进行酪蛋白酶谱和Western印迹检测M -钙蛋白酶。

 

结果：NACA治疗组的晶状体形态学检查表明，NACA能够逆转白内障分级。此外，谷胱甘肽水平、巯基转移酶活性、M-钙蛋白酶活性和M-钙蛋白酶水平（如Western blot所评估的）在NACA治疗组中均显著高于亚硒酸钠诱导的白内障组。此外，亚硒酸钠注射的大鼠有显著较高的丙二醛、谷胱甘肽还原酶活性和钙水平，经NACA治疗后，其水平降低至对照水平。

 

结论：数据表明，NACA具有显著改善视力和减轻白内障相关功能丧失的潜力。如NACA等药物制剂的开发最终可预防高危人群中白内障的形成，并可预防早期白内障的进展。这带来了从昂贵的白内障手术治疗到相对廉价的预防视力丧失的范式转变。

 

 

背景：影响视力的晶状体逐渐失去透明度形成白内障。白内障的发病机制是多因素的，涉及的机制尚不完全清楚，氧化应激是引发白内障形成的首要原因。氧化应激意味着氧化剂产生率和解毒率之间的不平衡，生产速率明显高于抗氧化剂解毒率。生物体用天然抗氧化防御系统抵消这种情况，但随着年龄的增长，氧化剂积累，而抗氧化防御逐渐减弱，这可能是年龄相关性白内障形成的最重要的机制。Shearer提出氧化应激参与亚硒酸钠诱导的白内障和导致白内障形成。据推测，亚硒酸盐引起的氧化损伤可能涉及关键的巯基氧化钙ATP酶或离子通道。这可能导致晶状体上皮细胞代谢的改变，钙ATP酶活性丧失，因此钙在晶状体核内蓄积，可激活m-钙蛋白酶。M-钙蛋白酶的激活启动β-晶状体蛋白水解，导致β和α-晶状体蛋白溶出，γ-结晶蛋白共沉淀，最终形成白内障。由于氧化应激与白内障形成有关，应用能够成功穿透晶状体组织的抗氧化剂是消除氧化相关白内障发生的一种合乎逻辑的方法。抗氧化剂在治疗或预防氧化应激相关疾病中的应用越来越受欢迎，巯基抗氧化剂，如GSH、半胱氨酸和NAC，显示出一定的保护作用。然而，NAC分子在生理pH下的负电荷使其不能渗透细胞膜。这导致使用更高的剂量和延长治疗的计划。N-乙酰半胱氨酸酰胺（NACA）是NAC的一种类似物，已被证明比NAC更有效，由于其中性酰胺基团，增加其亲脂性，并因此，其渗透到细胞膜。这在以前的研究中已经得到证实，以及它螯合Cu2+、清除自由基和防止氧化应激的能力。基于这些结果，本研究的主要目的是评估NACA预防和/或逆转亚硒酸钠诱导的Wistar大鼠白内障形成的能力。我们证明NACA在产后9, 11，13天腹腔注射有助于防止致密核白内障形成。连续的NACA给药（从产后第15天到第30天）作为滴眼剂配方可逆转白内障的密度。我们的结果表明，NACA给药通过补充GSH、抑制脂质过氧化、防止钙蓄积，从而抑制活化的M-钙蛋白酶并最终保留晶状体晶状体蛋白，从而增强了亚硒酸盐给药动物的抗氧化防御。因此，NACA有望成为开发基于药物的白内障治疗的候选药物。

 

方法：试验设计：40只2日龄的雄性幼龄Wistar大鼠，饲养于温度约22度和湿度约55%的环境中，12/12的光暗循环环境。自由饮食和饮水，驯化一周后用于试验。将大鼠分为四组，（1）对照组，（2）NACA，（3）亚硒酸钠，和（4）NACA +亚硒酸钠，使每组有一只哺乳期雌性大鼠10只雄性幼崽。在NACA和NACA +亚硒酸钠组中的所有大鼠在出生后第9, 11，13天每天腹腔注射NACA（250毫克/千克）研究NACA对亚硒酸钠诱导的白内障的预防作用，而对照组和亚硒酸钠组接受腹腔注射磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。在产后第10天，亚硒酸钠和NACA +亚硒酸钠的所有大鼠接受腹腔注射亚硒酸钠（19μmol/kg），而对照组和NACA组接受等量的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制备1%的NACA滴眼液。从出生后第15天（大鼠睁开眼睛的那一天）开始，并持续到产后第30天，检查NACA对NACA+亚硒酸钠组白内障分级的逆转作用。在开始滴眼液前（产后第15天）和最后一天（产后第30天），用裂隙灯显微镜检查白内障分级。最后一次给药NACA或缓冲剂滴眼液后，腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（15 mg/kg），所有大鼠麻醉2～3小时。在研究的开始和结束时测量大鼠幼崽的重量。安乐死后立即取出晶状体，并立即放置在干冰上。样品在80℃的温度下储存，以作进一步的分析。

 

大鼠眼形态学观察：大鼠眼睛的形态学检查类似于Carey等人所描述的过程。在检查前1小时，滴注2.5%盐酸去氧肾上腺素和1%托吡卡胺眼液滴眼，以开始散瞳。用裂隙灯显微镜进行10倍放大检查。拍摄代表性的照片。白内障按以下比例分级：透明晶状体，0级；晶状体轻度不透明度，1级；晶状体部分核不透明度，2级；晶状体致密核不透明度，3级。

 

谷胱甘肽水平的测定：根据我们实验室开发的HPLC方法测定晶状体组织中的GSH水平，并对其进行了描述。简单地说，每个晶状体均在丝氨酸硼酸盐缓冲液（pH 7.8）中均匀化，然后在4℃离心5000×10分钟，取上清液并稀释。将50ul的稀释上清液加入到200ul的纳米水中。每个样品中加入750μl的 1mM溶于乙腈的NPM。在室温下进行5分钟的衍生反应，然后加入10μl的2 N HCl，使反应猝灭。每个样品通过0.45μm孔过滤器转移到HPLC瓶。进行分析。

 

谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）含量的测定：用反相高效液相色谱法测定总谷胱甘肽含量，制备晶状体匀浆，并按上述方法对GSH进行分析。然后将50μL稀释的上清液加入到60μl的NaDPH（2 mg/ml）的纳米水中。加入20μL的谷胱甘肽还原酶（1单位/ml），室温下孵育5分钟。孵育后加入120ul纳米水，然后加入750ul 1 mM的NPM进行衍生化。室温下5分钟后，加入10μl的2 N HCl使反应猝灭。使用反相高效液相色谱进行分析。

 

结果：NACA 和亚硒酸钠对晶状体白内障形成的影响：在产后第10天腹腔注射亚硒酸钠（19μmol/kg）足以诱导白内障形成，在大鼠睁开眼睛时可见。用裂隙灯显微镜观察大鼠幼崽的眼睛，发现所有只注射亚硒酸钠的动物出现白内障：20%形成二级白内障，80%形成三级白内障。相比之下，NACA腹腔注射降低了白内障形成的严重程度；十只大鼠中有八只（80%）出现了2级白内障，而1只大鼠形成了1级白内障，1只大鼠没有发生任何白内障（0级）。这些结果表明，NACA在预防白内障形成方面是成功的。到第4周时，注射亚硒酸钠大鼠白内障的等级没有变化十只大鼠中有八只（80%）患有白内障3级，2只大鼠有2级白内障。而，NACA眼药水的治疗降低了白内障形成的严重程度，其中十例（50%）中有五只大鼠出现2级白内障，四只大鼠有1级白内障，1只大鼠没有白内障（0级）。

 

NACA对晶状体GSH和GSSG水平的影响：亚硒酸钠组晶状体GSH含量明显低于对照组和NACA组。与亚硒酸钠组相比，NACA＋亚硒酸钠组，NACA治疗明显升高GSH水平升高。与对照组相比，亚硒酸钠组晶状体GSSG含量明显高于对照组。然而，NACA处理（NACA+亚硒酸钠）不能降低GSSG水平至对照。亚硒酸钠组晶状体GSH和GSSG比值明显低于对照组，而NACA治疗组（NACA+亚硒酸钠）GSH/GSSG比值接近对照组。

 

结论：数据表明，氧化应激在白内障形成中起作用，特别是谷胱甘肽的维持。因此，GSH前药作为预防和逆转白内障的治疗剂是有效的。数据支持我们的假设，即NACA通过增加GSH来保护，降低MDA水平，恢复酶活性，并使钙水平正常化。我们的未来研究将集中于研究NACA滴眼液的有效性及其在不同的白内障形成动物模型中的药代动力学特征。