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提高孵化温度和建立zftool增殖指数改善斑马鱼胚胎异种移植条件

2018年04月28日 浏览量: 评论(0) 来源:BMC Cancer December 2018, 18:3 | Cite as 作者:李晓菲译 责任编辑:yjcadmin
摘要:斑马鱼是一种模式生物,已经成为癌症研究的工具。在发达国家,癌症是仅次于人类心血管疾病的第二大死亡原因。斑马鱼是人癌细胞异种移植和体内不同化疗药物的毒性研究的有效模型。与鼠模型相比,斑马鱼模型更快速,可以使用高通量方法筛选,并且具有较低的维护成本,使得建立个性化治疗成为可能和负担得起。虽然已经开发了几种基于图像采集和量化的细胞增殖测定方法,但仍存在一些缺陷。在异种移植技术中,量化体内细胞增殖对于规范该模型的未来临床前应用至关重要。

摘要:斑马鱼是一种模式生物,已经成为癌症研究的工具。在发达国家,癌症是仅次于人类心血管疾病的第二大死亡原因。斑马鱼是人癌细胞异种移植和体内不同化疗药物的毒性研究的有效模型。与鼠模型相比,斑马鱼模型更快速,可以使用高通量方法筛选,并且具有较低的维护成本,使得建立个性化治疗成为可能和负担得起。虽然已经开发了几种基于图像采集和量化的细胞增殖测定方法,但仍存在一些缺陷。在异种移植技术中,量化体内细胞增殖对于规范该模型的未来临床前应用至关重要。

 

方法:这项研究改进了异种移植技术的条件。量化细胞增殖的条件是通过zftool软件图像处理和优化温度规范未来的临床应用过程。zftool建立基准阈值消除胚胎自体荧光,并测量标记细胞(GFP)的面积和这些细胞的强度,以定义"增殖指数"。

 

结果:不同温度(34°C和36°C)的肿瘤细胞增殖与体外细胞增殖相比,具有更好的增殖率,在36°时达到预期的效果,但仍未显示出维持温度。胚胎的死亡率保持在5%和15%之间。5 - 氟尿嘧啶测试2天,溶解在培养基中,以量化注射后肿瘤肿块的减少。36°C孵育的胚胎中,几乎与5-氟尿嘧啶一起孵育,与对照组相比,肿瘤细胞明显减少。但34°C未出现该情况。

 

结论:结果表明,在36℃时,肿瘤的增殖更好,并且这种温度是最适合用于检测化疗药物如5-氟尿嘧啶。

 

关键词:斑马鱼  异种移植  肿瘤 5-fu  增殖  温度 Zftool

 

背景:模式生物对于了解人类疾病非常重要。在现有脊椎动物模型中,遗传和实验斑马鱼和小鼠模型显著促进了我们对癌症生物学和治疗的洞察力,很大程度上是因为它们与人类共享的高基因组相似性。斑马鱼模型已广泛应用于生物医学研究中,有以下几个原因,其中包括大量的后代、小的物理尺寸、低的维护成本、遗传修饰线的可用性、胚胎透明性以及最重要的是使用少量的药物。药物筛选试验中检测新化合物所需的少量药物。在动物模型中进行肿瘤移植是非常有价值的,不仅能提供肿瘤生长和肿瘤细胞转移潜能的数据,而且还提供了在体内动物实验中测试药物的可能性。一些研究已经证明斑马鱼是一种极好的移植肿瘤细胞系或原发性患者来源细胞的模型。具体而言,斑马鱼有三种机会可用于肿瘤细胞移植:1)胚胎期,当先天免疫系统存在时,但所获得的免疫系统尚未完全发育。2)成年鱼行移植,如Casper,排斥抑制治疗。3)最近开发的免疫力低下的成年rag2e450fs突变的斑马鱼。最常用的方法为肿瘤异种移植实验斑马鱼是实时跟踪肿瘤细胞(用不同的荧光染料标记或组成型表达荧光蛋白在细胞质中),通过显微注射到48小时斑马鱼胚胎的特定区域。肿瘤细胞增殖和侵袭能力可以在几天内进行分析。与小鼠异种移植模型相比,斑马鱼模型提供了几个优点,包括可以注射的胚胎数量很多,允许在几天内对上述参数进行统计分析。用96孔板法测试几种浓度/药物组合的可能性。以及胚胎中缺乏获得的免疫系统,这有利于肿瘤细胞的植入。作为一种有前景的模型,使用斑马鱼进行异种移植试验时需要考虑几个缺陷。最重要的限制之一是温度(28°C),这些鱼在日常维持中,与人体(37°C)相差9度。后者是肿瘤细胞增殖的理想温度。为了解决这个问题,有几个小组描述了斑马鱼异种移植物的培养温度,范围从31°C到34°C。作为人类细胞增殖与斑马鱼成活的最佳温度之间的折衷方案。胚胎内细胞增殖的分析是另一个挑战,考虑到需要以高分辨率成像的大量鱼类,以及短时间用于测试不同化合物并检查对注射细胞的影响。不同的图像分析可以使用商业和自由软件来估计在实验开始和结束时的细胞数量,但是这些技术不够精确,不能可靠地测量细胞的增殖,因为它们依赖于用户干预,手动调节每个图像的参数。软件zftool,解决面临的斑马鱼成像用于提取增殖指数的特点存在的问题(面积和平均强度与GFP点)自动计算和适应每一条鱼的自体荧光特征。在体内系统中,在几乎等于人体的温度下,快速有效地检测不同化疗药物的技术。在本研究中,我们提出了斑马鱼卵黄异种移植试验,连同图像分析软件,给斑马鱼异种移植目前面临的主要问题提供了一个答案。建立肿瘤细胞注射和增殖条件,实验在36℃下进行,这是以前尚未报道的温度。使用条件下胚胎表现出良好的整体生存率,促进了肿瘤的生长,随着新自成像分析软件zftool获得自动测量,以高重现性准确监测肿瘤生长,以产生可靠结果。

 

方法:斑马鱼:12月龄斑马鱼饲养在28度,30L水族箱中,光暗周期14:10。交配获得斑马鱼胚胎。使用过量三卡因对斑马鱼实施安乐死。

 

试剂与细胞培养:人结肠癌细胞株HCT116,在37°C,5% CO2条件下培养在含10%胎牛血清和1%青/链球菌的麦考伊5A培养基中。HCT116细胞株转染表达GFP,每月检测HCT116污染。

 

荧光GFP细胞标记:HCT116细胞转导使用慢病毒驱动GFP构建。细胞被感染后72小时在选择压力下使用10μg/ml嘌呤霉素。流式细胞术检测GFP阳性细胞的表达率。

 

细胞增殖实验:使用xCELLigence实时细胞分析仪测定细胞增殖;细胞注射:受精后2天,斑马鱼胚胎用0.003%三卡因麻醉。10000-20000个/μL细胞悬浮在完全麦考伊培养基中。在注射前保持室温不超过2小时。将细胞悬浮液装入硼硅酸盐玻璃毛细管针中,注射用im-31电动微量注射器,输出压力为34 kPa,注入时间为30毫秒。人工直接进入胚胎卵黄注射。卵黄内未注射细胞的胚胎被丢弃。

 

孵化、成像和细胞定量:注射后,2dpf胚胎在两种不同条件下孵育(34°C或36°C),在24孔板中脱氯自来水人工盐中孵育72小时,zftool检查的细胞增殖。每块板至少包含2个阴性对照组(注射完全麦考伊培养基)和2个空白(不注射)。在12个阴性对照和12个空白的实验中,另一个板被包含在一些实验中以测试胚胎的活力。在此温度下孵育时没有观察到发育异常。为了达到36℃培养温度而不出现大量的胚胎死亡,板用透明密封带(PCR塑料)覆盖,以防止溶解氧的蒸发和还原。之后,将板放置在孵化器内,在板和孵化器结构之间最小接触,以防止水过热。az-100尼康荧光显微镜拍摄每个胚胎,并使用Zftool分析。计算增殖指数。这种分析产生的图像中的像素数(ngfp GFP),它代表的卵黄囊内细胞的区域在不同的时间和GFP中强度值(GMV),代表蛋黄内部荧光强度的中强度值。由ngfp数乘以每个图像的GMV,我们确定0 HPI和72 HPI之间的增殖率来估计细胞的生长。结果由72 HPI除以0 HPI获得,产生增殖指数值。斑马鱼胚胎具有可变的自体荧光,特别是卵黄区。为了精确地定量注入的细胞荧光,需要预先处理仅计算属于过滤细胞的GFP像素,过滤自体荧光。为了实现这一点,该软件对具有不同强度阈值的GFP像素的数目进行计数,从0(无阈值)到50。在胚胎中没有自体荧光的情况下,基于容差参数建立阈值,并包括校正以确保在这种情况下测量的准确性。

 

抗癌药物的毒性与治疗:各种指标(如凝血、胚胎的体节形成,尾巴的或心跳缺乏、)在实验过程中每24小时检查一次,检测胚胎死亡率计算LC50(致死浓度50%)。该药物被测试以确定浓度范围,包括0到100%的死亡率。实验被认为是有效的,卵子受精≥70%。在开始时,氧浓度应≥80%饱和度,水的温度应该是26±1°C. 测试过程中,实验中的任何时间阴性对照胚胎死亡率不能≥10%。暴露于阳性对照导致最终的最小死亡率为30%。96 h阴性对照的胚胎的孵化率高于80%。检测浓度为250μM,500μM,1000μM,1500μM,2000μM,1% DMSO。改变治疗的起点从0 - 48hpf,为了评估导致胚胎改变的毒性。

 

结果:斑马鱼在34°C和36°C的存活率:对照组(注射培养基)和空白组(未注射组)的存活率均高于95%。数据显示,34°C(95.37%)和36°C(87.5%)生存率存在差异,但统计学分析无显著性差异。36,5°C或以上的胚胎的生存受到严重影响和严重变形。尽管在两个温度之间观察到差异,但在36°C的实验显示,如果我们要模拟人体条件,在细胞增殖、代谢和注射细胞的行为方面显示出足够的鱼存活率。

 

HCT116细胞增殖实验研究:xCELLigence技术用来检测34和36 C°体外细胞的增殖。每孔的初始细胞浓度(2、5、10个细胞)。

 

图像分析:该工具自动消除鱼类自体荧光,因为这些像素干扰GFP面积的测量。最暗的GFP像素对应于鱼类自体荧光,并且在测量GFP面积和平均强度时不能包含这些像素。zftool自动建立每个鱼GFP的门槛,代表不同阈值的GFP面积图的衰变。当差值低于10%时,阈值是固定的,从而产生仅突出肿瘤细胞团的GFP面积的图像,从而产生更精确的结果。容差参数建立相对于0阈值的面积的衰减百分比。在进行实验时,我们注意到在两个温度下的细胞增殖取决于初始细胞负荷变化。zftool延伸开发注射前自动细胞计数。72小时后的增殖保持不变,与0小时相比没有统计学显著性。

 

两种不同温度体内增殖分析:本实验的目的是检测在接近人体(36.5°C)的温度下是否存在更好的增殖指数。胚胎移植后孵育在两个不同的温度下进行(34°C和36°C)检测不同温度肿瘤细胞表现。结果在36°C显示HCT116细胞增殖(2.4237)。34°CHCT116细胞增殖(0.6253)。在这种情况下没有检测到增殖,相反地,由于缺乏荧光,细胞可能死亡。这些结果与体外实验结果一致。

 

5-氟尿嘧啶毒性试验:使用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)进行毒性试验,以建立合适的浓度,以便在以后的试验中使用。测试了相同浓度的胚胎,保证胚胎存活的理想浓度为500μM。在36°C和48hpf,使用这种化合物的胚胎死亡率高于26°C和0 hpf。在36°C下注射的肿瘤细胞与对照组相比减少,但在34°C没有观察到减少。在34°C,对照组的增殖指数为0.4748,5-氟尿嘧啶处理的鱼的增殖率为0.5415,对照组和处理组之间的差异无统计学意义。在36°C时,对照组增殖率为2.6653,5-氟尿嘧啶处理组的增殖率为1.9592。增殖指数具有统计学意义。统计分析表明,在这个温度下,对照组和治疗组之间有显著性差异。

 

结果:在36°C,注射到斑马鱼胚胎的大肠癌HCT116细胞具有良好的增殖指数。此外,36°C是检测5-氟尿嘧啶等化疗药物最合适的温度。

 

对不起,暂无资料。
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