摘要：囊性纤维化（CF）肺部疾病以慢性感染、炎症、气道重塑和粘液梗阻为特征。CF小鼠模型中肺部表现欠佳阻碍了气道疾病发病机制的研究，也阻碍了潜在疗法的发展和测试。最近的CF动物模型包括：大鼠，雪貂和猪。显示一系列具有不同严重程度的肺病表型特征。本文综述了目前可用的CF动物模型的气道表型，介绍了各模型在气道相关CF研究中的潜在应用。

 

 

背景：囊性纤维化（CF）动物模型是了解CF发病机制和发展治疗策略的关键。考虑到CF影响包括胃肠道、肺、胰腺、肝脏和生殖器官在内的多个器官，需要产生精确捕获所有疾病面的动物模型。在过去的20年中，体内CF相关研究主要使用转基因小鼠模型。已被证明这些小鼠模型对研究CF病理生理学方面是非常宝贵的，但是，它们有局限性。小鼠和人体解剖和生理学之间的明显差异意味着在人类中观察到的表型并不总是在小鼠体内复制。研究CF气道疾病在小鼠模型中的某些特征已被证明是有问题的。因为CF小鼠不能发展出包括粘液阻塞、慢性细菌感染和持续性炎症的特征。在所有与人类CF相关的临床表现中，进行性肺部疾病是患者发病和死亡的主要原因。因此，准确的CF肺疾病发生和发展的动物模型对于研究发病机制、识别潜在的治疗靶点和测试实验治疗是必不可少的。随着CF小鼠模型的建立，在开发CF肺病动物模型时，考虑到物种特性是很重要的。可能影响物种选择的特征包括气道细胞结构，特别是粘膜下腺体的分布和丰度、替代氯分泌途径的优势，以及囊性纤维化跨膜传导（CFTR）的结构和功能的保护。自CF小鼠模型的发展以来，基因工程的进展促进了一些替代模型的产生，包括CFTR敲除大鼠、敲除雪貂、两个敲除猪模型和包含共同PHE508DEL CFTR突变的猪。CFTR敲除和PHE508DEL突变体CF兔模型早期也有报道。由于绵羊和人肺的相似性，长期以来就提出了一种CF绵羊模型的产生。虽然CF绵羊模型尚未建立，基因编辑的快速发展可以促进其在不久的将来产生。本综述详细介绍了现有的CF动物模型气道疾病表型，并检查他们的优势和劣势。

 

肺疾病病理生理学：在研究动物模型中观察到的表型之前，了解CF肺病的潜在病理生理学是必要的。在正常条件下，CFTR蛋白作为上皮阴离子通道，负责环AMP依赖的氯化物和碳酸氢盐分泌，以及上皮细胞钠通道（ENaC）的调节。当CFTR基因发生突变时，CF产生，随后扰乱上皮离子转运。迄今为止，已鉴定出超过2000种致病性CFTR突变。这些突变根据CFTR功能障碍的机制分为6类，包括缺陷的蛋白质合成和加工、功能失调的通道调节和传导，以及降低蛋白质合成和稳定性。最常见的CF引起突变是II类突变PHE508DEL，约90%的CF患者携带一份拷贝。虽然CFTR在跨上皮离子转运中的作用被广泛接受，但CF肺疾病发展的确切机制早已争论不休。关于CF肺疾病的发病机制提出了若干假说。具有大量证据支持理论被称为"低容量"假说。这一理论假设，由于功能失调CFTR减少的跨膜氯离子转运，以及由于缺乏CFTR依赖性抑制eNAC引起的钠吸收增加，造成离子失衡，导致渗透渗透到组织中的水吸收，减少气道表面层（ASL）水合作用。耗尽的ASL导致粘液层脱水，粘性粘液粘附于气道表面。粘液淤滞和黏膜纤毛清除受损（MCC）导致吸入微生物的无效清除。细菌粘附在气道粘液上，最终形成生物膜，有效地躲避抗菌物质和宿主嗜中性粒细胞。随着时间的推移，更多的抗性和非典型生物聚集在呼吸道中，包括分枝杆菌、酵母菌和真菌。慢性肺部感染的状态引起持续的炎症反应，导致气道组织破坏、支气管扩张、肺功能逐渐丧失，最终导致呼吸衰竭。

 

CF小鼠肺部疾病表型的研究：CF小鼠模型的疾病表型和严重程度由于基因背景的多样性和用于产生动物的基因打靶策略的差异而趋于异质性。CF小鼠没有表现出任何肺部病理学，新的证据表明，它们确实表现出一些人类肺脏疾病的表型。与人类CF气道早期肺表型相似，多个研究表明CF小鼠显示了改变的呼吸力学。当CF和野生型小鼠的肺在反复暴露炎症刺激物（铜绿假单胞菌的脂多糖）下时，会引起炎症反应的状态，CF小鼠肺脏经历重塑和形态学改变，而野生型小鼠的气道能够有效恢复。最近的研究还表明，CF小鼠自发博德特拉呼吸道感染。虽然CF小鼠表现出肺部疾病的特征，但它们的使用有一定的局限性，因为它们没有表现出由慢性呼吸道感染、炎症、粘液堵塞和进行性支气管扩张构成的人类CF-肺疾病的严重病理特征。一些理论可以解释为什么CF小鼠不能发展出在人类身上观察到的显性肺部疾病。一是在CF小鼠中上调修饰基因，导致部分离子转运缺陷的部分校正。钙激活氯离子通道（CaCc）分泌途径在CF小鼠气道上皮中的优势。这种适应性机制弥补了CFTR介导的氯离子转运的缺陷，从而纠正了潜在的离子失衡，保护了小鼠气道免受疾病的侵袭。除了CF小鼠气道中CaCc的上调外，cAMP介导的CFTR通路在小鼠呼吸道上皮中的作用通常不占主导地位。成年CF小鼠的下呼吸道不显示具有人CF气道特征的电缺陷，包括减少cAMP介导的氯化物分泌和钠高吸收。ENaC的过度活动在CF肺疾病的发病机制中起重要作用，因为它被认为有助于ASL的衰竭和随后的一系列事件，包括粘液堆积、受损的MCC、感染和炎症和肺组织损伤。CF小鼠模型下气道缺乏高钠吸收可能解释肺疾病发展的缺失。CFTR在小鼠体内的结构和功能不同。对CFTR同源性的研究表明，小鼠CFTR仅在氨基酸水平上与人CFTR保守88%，因此，小鼠CFTR通道对人CFTR表现出不同的药理学。人气道CFTR蛋白主要表达于纤毛上皮和黏膜下腺体，因此小鼠和人气道组织学差异可以解释CF小鼠肺病的发生。小鼠和人气道在细胞结构上是不同的；人的远端气道主要由纤毛细胞组成，而小鼠下呼吸道主要是非纤毛的、分泌的、棒状细胞。此外，人气道在气管和支气管中有许多粘膜下腺体，而小鼠气道仅在喉部和近端气管中有少量腺体。由于粘膜下腺体与人CF气道疾病有牵连，它们在小鼠远端气道中的稀缺性可能导致肺病理生理学的缺乏。环境因素和宿主-病原体相互作用也可能起作用。CF肺部疾病在没有病原体存在的情况下不能有效建模，因此CF小鼠在半无菌和通常无特定病原体（SPF）条件下可防止通常在CF中观察到的肺部疾病的发展。然而，这个理论似乎没有被证实，因为在非无菌环境中饲养的CF小鼠仍然不能发展成肺部疾病。

 

CF小鼠上气道和气管表型：一些CF小鼠株在上呼吸道和气管中显示轻度表型。观察到的特征包括鼻腔粘膜下扩张的粘膜腺、鼻窦浆液腺组织萎缩、鼻中隔杯状细胞增生和鼻腔上皮细胞的ASL减少。CFTR／/-小鼠模型也表现出显著的气管异常，如软骨环不完整和平滑肌面积减少。CFTRtm1HGU和CFTRtm1UNC株气管的MCC受损也已被报道，然而，这些发现已被其他人发现，MCC在CFTRtm1UNC小鼠中不受影响。CF小鼠的鼻腔上皮表现出与人CF气道相似的生物电异常，包括减少的氯离子转运和钠高吸收。这些缺陷用鼻电位差（NPD）测量技术得到了很好的记录。一种评估，包括将充满液体的套管电极（连接到毫伏表）在鼻衬里上，以测量通过不同盐溶液的离子传输穿过上皮产生的电势。所有CF小鼠表现出减少的cAMP介导的鼻腔上皮细胞的分泌，这是人CF气道的特征。Enac的活性在人CFN鼻上皮中存在，在大多数CF小鼠模型的鼻上皮中也观察到，包括敲除、CFTR、F508和CFTRG51D菌株。当阿米洛利（阻断Enac介导的钠吸收的药物）通过CF小鼠的鼻上皮灌注时，出现明显的去极化反应，这与钠高吸收的存在相一致。由于CF小鼠的鼻腔上皮精确地反映了人类CF气道的电生理学特征，它已被证明用于检测替代功能失调CFTR的治疗剂（即基因疗法）和恢复正常离子转运的治疗剂的价值。携带PHE508DEL和GYL51ASP突变的小鼠菌株对于检测CFTR处理和贩运（CFTR校正）和缺陷通道门控（CFTR增强子）的化合物特别有用。然而，一些CFTR增强子增强人CFTR对小鼠CFTR没有任何影响，最有可能是由于小鼠CFTR通道性质的差异所致。一旦开发，HCFTR CF小鼠模型将有助于小分子药物的检测。

 

同源CFTR敲除小鼠模型：据推测，在混合遗传背景下产生CF小鼠模型导致上调修饰基因，从而防止肺部疾病的发展。为了验证这一理论，CFTRtm1UNC-CF小鼠品系在单一遗传背景下被重新开发并被称为B6CFTRtm1UNC。有趣的是，B6 CFTRtm1UNC小鼠出现肺部疾病表现，包括细支气管粘液潴留、组织纤维化、过度膨胀的肺泡和肺泡壁增厚。B6 CFTRtm1UNC小鼠肺也显示炎症细胞募集，观察到中性粒细胞的流入。这种炎症性疾病表型似乎是自发的，因为分析的小鼠被安置在SPF条件下，在炎症之前或炎症开始之前没有检测到呼吸道病原体。鼻PD显示表明同种CF小鼠表现出减少的氯化物分泌。然而，不同于混合背景CF小鼠菌株，对阿米洛利的反应在同种CF小鼠和野生型之间似乎不存在差异，提示同源CF小鼠在鼻上皮中不表现出钠高吸收。用P. aeruginosa挑战的B6 CFTRtm1UNC小鼠表现出减少控制感染的能力。据推测，同源B6CFTRtm1UNC小鼠由于缺乏或未能激活混合背景CF小鼠模型中通常存在的交替氯离子传导途径而发展出肺部疾病。B6 CFTRtm1UNC小鼠是少数表现炎症性肺部疾病的模型之一，因此，它已被用于探索长期争论的问题，即CF气道炎症是自发的，还是由感染引起的。尽管B6 CFTRtm1UNC小鼠显示了CF肺部疾病的方面，但仍使用原来的混合背景CF小鼠株。

 

β-ENaC小鼠模型：在现有的小鼠模型中，对CF肺病的病理生理学进行重新认识的困难导致β- EnaC小鼠（也被称为SCNN1B小鼠）的发展。β-Enac小鼠是一种转基因小鼠模型，它能过度表达肺中eNAC的β亚基，从而模拟CF人气道中的钠离子转运异常。β-Enac小鼠气道重塑CF肺疾病发病的关键过程，增加气道钠吸收导致ASL耗竭和粘液清除不足。因此，β-Enac小鼠表现出CF样肺部疾病，其特征包括粘液高分泌、传导气道粘液阻塞、MCC损伤（直接通过微透析直接测量）、杯状细胞化生和中性粒细胞气道炎症。使用成人β-Enac小鼠进行的初步研究未能检测到气道中的自发性细菌感染，然而，当用流感嗜血杆菌和P. aeruginosa、成人β-eNac小鼠气管内挑战时，与野生型小鼠相比，病原体清除能力受损。最近有关BAL纵向分析的研究表明，新生儿β-Enac小鼠存在自发性肺部感染。同一研究还发现，感染后β-Enac小鼠的肺部细菌负担和比例随着年龄的增长而下降，这归因于出生后发生的免疫系统的成熟。β-eNac小鼠为研究CF肺病的发病机制提供了一个相关的模型，特别是离子转运、ASL和MCC之间的相互作用。由β-eNac小鼠模拟的肺部疾病已经被证实用于开发新的呼吸诊断工具来定位和测量肺疾病的异质性。此外，β-Enac小鼠可用于评估一系列治疗，包括针对ASL耗竭、粘液梗阻和炎症的治疗。例如，β-eNac小鼠可用于试验eNAC抑制，以恢复正常的钠转运。这些方法包括使用eNAC拮抗剂，使用短干扰RNAs（siRNA）沉默eNAC表达，并抑制激活Enac的蛋白酶。然而，由于β- ENaC模型中CFTR的表达和功能没有改变，因此不适用于替代、纠正或增强CFTR的治疗。

 

CF大鼠模型：与较大的动物相比，大鼠具有短妊娠（21-23天）和早期性成熟（8周）的优势，从而允许快速繁殖。与大型动物相比，大鼠的动物饲养费用也较少，并被广泛用于研究目的，这意味着它们在生理学、药理学和毒理学方面都有很好的特点。与小鼠不同，大鼠在整个软骨气道（气管和初级支气管）中有广泛的粘膜下腺体，与人类相似。

 

CFTR基因敲除大鼠气道病变：CFTR-/-大鼠概括了CF.在人类身上观察到的肺部疾病的重要特征。然而，细胞往往表现出扩张，由于细胞内粘液水平的增加，表明有缺陷的粘液分泌。形态学上，6周龄CF大鼠的气管发育异常，与野生型大鼠相比，气管软骨和腺体面积减少。CF大鼠也显示ASL的显著耗竭，并且显著降低了纤毛液体（PCL）的深度。初步结果表明，年轻的CF大鼠表现出高酸性气道表面，类似于CF猪。最近的一项研究表明，CF儿童的ASL pH没有降低。尽管ASL的耗竭，年轻的CF大鼠的粘液纤毛运输（MCT）似乎不受影响（＜3个月）。然而，早期的证据表明，随着动物年龄和气道粘膜下腺的发展，与野生型相比MCT率显著降低。初步研究还表明，6月龄时，CF大鼠气道粘膜下腺粘液堵塞。CF大鼠气道中不存在自发感染和炎症，野生型和CFTR基因型之间无明显差异。虽然自发感染是不存在的，新的证据表明，类似于CF小鼠。CF大鼠对铜绿假单胞菌感染的清除能力减弱。

 

CF雪貂模型：由于雪貂与人肺细胞生物学和解剖学的相似性，正常雪貂肺已被用于模拟人类肺部感染，包括严重急性呼吸综合征和流感病毒。像人类一样，雪貂气道在整个气管和初级支气管中都有黏膜下腺体，表达高水平的CFTR。此外，雪貂和人近端软骨气道中的主要分泌细胞类型是杯状细胞，雪貂CFTR与人类CFTR（95%）也具有高度的氨基酸序列保护，因此，CFTR的生物电和药理学性质在雪貂和人类中是相似的。

 

CFTR敲除雪貂模型气道疾病的研究：CF雪貂表现出严重的肺表型。粘液堵塞在小气道和大气道中，并且在某些情况下，导致完全阻塞。除了粘液的存在外，还存在滞留空气和泄气肺泡（肺不张）。在CF雪貂气道中观察到粘膜下腺体和导管的扩张、杯状细胞增生以及粘液中的炎性细胞和细菌菌落的存在。支气管肺炎，坏死，炎症和肺痈是存在的。CF雪貂偶尔也会出现鼻窦粘液堆积和炎症。当使用外周气管中的荧光珠迁移测量MCC时，CF雪貂表现出显著减少。

 

CF猪模型：人与猪在解剖学、生理学、生物化学、大小、寿命和遗传学方面的相似之处使猪成为模拟人类疾病的合适候选者。猪肺与人的肺有多种解剖和组织学特征，包括相似的气管-支气管树结构和气道粘膜下腺体的丰度。猪以前被用来模拟肺部疾病，包括炎症和感染，如慢性支气管炎。随着人类CF肺疾病在个体寿命中的进展，猪的寿命允许对肺病发病机制和治疗学的评估进行长期研究，这在啮齿动物或雪貂模型中是不可能的，因为它们的寿命相对较短或更差。猪CFTR氨基酸序列也与人保守95%，猪呼吸道上皮和粘膜下腺体的电生理特性与人类所观察到的相似。

 

CF猪模型气道病变：CFTR-/-, CFTRΔF508/ΔF508 and CFTR-/ΔF508猪在出生后的数月内自发表现出人类CF肺疾病的主要特征，这些表现包括气道炎症、感染、组织重塑、粘液积聚和梗阻。CF猪表现出异质性气道重塑，一些病例显示杯状细胞增生，气道壁增厚。患有呼吸道阻塞的CF猪，包括肺不张、过度充气、空气诱捕和肺炎。脓性物质似乎阻塞气管和支气管，通常含有细菌、中性粒细胞和巨噬细胞。

 

结论：CF小鼠模型已被用于研究CF的许多方面，但它们在气道相关研究中的应用受到限制，因为它们仅表现出CF肺疾病的轻度特征，使用细菌挑战法诱导气道疾病具有局限性。虽然CF小鼠的鼻腔上皮为探索发病机制和评估治疗提供了平台，但缺乏明显的下呼吸道疾病表现和菌株之间高度的表型异质性意味着需要新的模型。β-eNac小鼠为CF小鼠提供了一种有用的替代物，因为它模拟了下呼吸道阻塞，虽然它不适用于所有的应用，因为CFTR的表达和功能不受影响。努力克服现有的小鼠模型的缺陷导致了新的CF动物模型的开发，包括CF大鼠、雪貂和猪模型。CFTR敲除大鼠表现出许多肺表型，包括气道表面缺陷、鼻腔和气管组织中的CF样电分布、异常粘液生成和气管畸形。由CF雪貂所建模的肺部疾病与人类所观察到的有许多相似之处。同时存在的气道炎症、感染和粘液阻塞为进一步阐明肺疾病的发病机制，以及在与人类CF患者密切复制的肺环境中的治疗方法提供了非常有价值的平台。猪与人类共有多种气道特征，使它们适合开发CF肺病模型。最近产生的CFTR敲除和PHE508DEL突变猪模型表现出肺部疾病的特征，包括炎症、气道阻塞和感染，这将有助于基础和临床前气道的相关研究。准确地概括人类CF-肺疾病特征的动物模型将为研究人员提供实验性肺治疗的资源，识别新的治疗靶点，并阐明CF肺部疾病的复杂机制。虽然CF肺病的完美模型不存在，但每种动物模型都有独特的优点，可以互补地用于研究CF相关的问题。