摘要：滑膜炎是一种与类风湿关节炎、骨关节炎、感染和创伤有关的炎症相关疾病。这种炎症伴随着免疫细胞浸润，引起炎症反应，引起疼痛、不适和影响正常关节功能。滑膜炎的治疗是基于给予抗炎药物或生物制剂如富血小板血浆和间充质干细胞。然而，更有效的滑膜炎治疗方法的评价和验证需要建立与临床相关的动物模型。

 

结果：在这项研究中，大白猪预先免疫评估抗原诱导的滑膜炎。 滑膜液在该模型中的免疫监测使我们能够识别IL-12P40和T细胞亚群作为免疫生物标志物。此外，滑膜炎的演变是通过关节镜手术和动力学分析。本文描述了一种抗原诱导的滑膜炎动物模型被用于抗炎治疗评价。

 

结论：本文的新颖之处在于开发了一种临床相关的滑膜炎模型，它允许从免疫学、外科学和动力学的角度同时评价滑膜炎。

 

 

背景：滑液（SF）是一种血浆，为正常关节功能提供低摩擦力。SF的稳态依赖于从淋巴管到关节腔的持续更新和对毛细血管的滑膜过滤。体育锻炼和关节屈曲也有助于这种更新。滑膜炎是一种炎症相关疾病，通常与类风湿关节炎、骨关节炎和病毒感染有关。滑膜组织的炎症伴随着免疫细胞浸润（主要由巨噬细胞和T淋巴细胞和B淋巴细胞组成），引起炎症反应，疼痛和不适，影响正常关节功能。目前，一些最常见的治疗滑膜炎的方法是基于非甾体抗炎药和生物制剂，如富含血小板的血浆、自体条件培养基和间充质干细胞，它们从不同的来源分离。由于其自我更新能力、多潜能性和免疫调节特性，在再生医学中成为一种很有前景的治疗选择。类似于其他疾病，开发更有效的治疗滑膜炎的方法需要建立与临床相关的动物模型。这种炎症相关疾病的有价值的动物模型应该适合于评价免疫生物标志物和运动学参数。目前已报道了几种动物模型，包括狗、大鼠和兔。然而，由于其翻译的适用性，其他大型动物模型，如猪或绵羊已被认为是用于这类研究更合适的模型。猪和人类在软骨厚度、生物力学特征和关节尺寸方面的形态和生理相似性成为该动物模型特别有吸引力的特征。这项工作的目的是开发和表征临床相关的大动物滑膜炎模型。这篇文章的新颖之处在于开发了一种动物模型，该模型允许研究者从不同的角度对滑膜炎进行评价、监测和随访：首先，从免疫学角度评价免疫生物标志物（滑液淋巴细胞和IL-12p40），其次，从生物力学和手术的角度过关节镜和动态步态进行分析。

 

方法：动物和实验设计：八头大白猪被安置在微创手术中心的动物设施中，用于所有实验过程。年龄为3个月和体重25～35公斤。所有动物均通过皮下注射牛血清白蛋白（BSA）进行预免疫。通过每个动物的右腕关节内注射BSA，进行滑膜炎诱导的局部免疫。左腕关节接受关节内注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为阴性对照。对照组，三头大白猪不进行BSA预免疫。左腕关节内注射PBS和右腕关节内注射BSA。

 

麻醉程序：麻醉状态下进行手术。肌肉注射10 mg/kg氯胺酮和0.02 mg／kg盐酸右美托咪啶用于血液取样和皮下BSA注射。使用阿替美唑盐酸盐进行复苏。为了SF取样和关节镜检查，静脉注射相同剂量的丙泊酚2 mg/kg，用3 mg/kg曲马多进行镇痛。根据伦理和动物福利问题，所有动物都接受盐酸丁丙诺啡的镇痛治疗。关节腔内注射后，0.3 mg/ml丁丙诺啡以0.03 mL/kg的常规给药7天。

 

免疫方案：为动物免疫，制备了20mg/ml的牛血清白蛋白溶液，并通过0.2μm灭菌的微滤器。等体积的弗氏完全佐剂（FCA）与BSA溶液混合并乳化。通过皮下注射这种乳剂进行免疫。在第0, 14天和第21天共注射0.4毫升/公斤。第28天，从两个关节（SF基础样品）抽吸0.5毫升SF，在前肢进行BSA关节内免疫。在右腕关节共注射0.5ml的BSA 20 mg/ml，诱导滑膜炎，左侧腕关节0.5 ml PBS（阴性对照）。

 

滑膜液和外周血淋巴细胞的分离及表型特征：从腕关节获得滑膜液白细胞（SFL）。吸入0.5-1ml SF，每周取样连续五周。在自动血细胞分析仪中计数白细胞，900×G离心分离SFLs，用于流式细胞术分析。收集上清液并保存在-20℃测定细胞因子。颈静脉血标本采集外周血淋巴细胞（PBL），从研究开始每周进行血液取样。PBLs离心分离，用PBS洗涤两次，用于细胞分析。流式细胞术分析，PBLs和SFLs悬浮在含有2% FBS的PBS中。然后用猪CD4和APC结合猪CD8单克隆抗体的PACP结合单克隆抗体对细胞进行染色。流式细胞仪检测结果如下：在4℃，用合适浓度的单克隆抗体同2×105细胞孵育30 min。将细胞洗净再悬浮于PBS中，采用流式细胞仪进行分析。

 

抗BSA抗体的ELISA定量分析：为了量化免疫动物的抗BSA IgG滴度，对血浆样品进行ELISA试验。采用BSA在20μg/ml过夜孵育法进行微孔板包衣。第二天，用200μL的PBS/TWEN-20（0.05%，7.4 pH）洗涤两次。为了防止抗体的非特异性结合，通过加入200μL牛血清白蛋白阻断其余蛋白结合位点，并在4°C孵育2小时。用200μL PBS/TWEN-20清洗四次，血浆样品用1/200和100μl的PBS稀释，加入到每个孔中。在4℃下孵育2小时。用PBS/TWEN-20洗涤四次后，加入100μl的1/5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗，并在4℃下培养2小时。洗净四次，每孔加入100μl酶底物TMB。两分钟后，每孔加入100μl的1 N HCl，以阻止反应。在450 nm处用分光光度计测量板吸光度。

 

细胞因子检测：SF上清液在PBS中1∶4稀释，储存于-20℃。解冻后，分析IFNα, IFNγ, IL-1b, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40 和TNFα。

 

关节镜检查：为了评价关节状态的潜在变化，在关节内PBS或BSA注射后两周内，在预免疫动物的腕关节中进行关节镜检查。手术中使用的关节镜为霍普金斯?广角前斜望远镜30°，直径2.4毫米，长度10厘米。用一根针作为关节镜，通过小切口正确放置关节镜。在整个过程中保持通过关节的盐水通量，以提供更好的组织可视化。对关节进行仔细和详细的评估并记录照片。3毫米切口用2～0可吸收缝线闭合。关节镜术后7天内每只动物接受抗生素治疗（克拉维酸+阿莫西林）。

 

基于生物力学分析的压力平台步态分析功能评价：174.5厘米×36.9厘米的压力平台（PP），由单个传感器组成，其密度为1.4传感器/CM2，总传感器为9152个，用于生物力学评价。PP人行道的传感器进行了校准。关节内注射后七天，引导动物沿PP行走，并在每个动物至少5次后，对数据进行分析。

 

结果：BSA诱发抗体和T细胞应答：第0, 14和21天，动物皮下免疫BSA和FCA。在免疫方案中，每周从静脉采集外周血，用流式细胞术分析CD4+T细胞、CD8+T细胞比例及其比值。抗CD4和抗CD8抗体同时用于定量CD4+/CD8-和CD4 -/CD8+亚群。BSA免疫动物外周血淋巴细胞分析显示CD8+T细胞亚群呈增加趋势（无统计学意义），CD4+T细胞亚群和CD4/CD8比值均呈下降趋势。结果表明，在所有四只动物中都检测到抗BSA IgG抗体滴度。抗体浓度在7天和14天内显著增加，从第14天到第35天保持稳定，4周时达到最大水平。基于这些免疫测定，在这里我们证明BSA免疫方案触发了该动物模型的预致敏，这是产生抗原诱导滑膜炎的先决条件。

 

对免疫前动物BSA的关节内给药改变白细胞计数和滑膜淋巴细胞分布：预敏化的动物（在第0, 14天和第21天皮下用BSA免疫）在第28天分别在左侧或右侧腕关节接受关节内注射PBS或BSA。基础样品在PBS或BSA注射前第28天抽吸。在第35，42，49，56天吸取滑膜液。将滑液离心，滑膜白细胞进行流式细胞术分析。滑膜液的非细胞部分被冷冻用于随后的细胞因子分析。滑膜液中白细胞计数显示，在第35天（关节内BSA注射后7天），在BSA关节内注射的关节中白细胞计数显著增加（P＝0.04）：对照样本为0.75±1.12×106 /ml，BSA注入组为2.40±1.19×106／ml。此外，淋巴和骨髓用自动血液分析仪定量滑膜细胞。对照组淋巴/髓样细胞分布为：67.95±6.57（淋巴样细胞%）和32.05±8.11（髓系细胞%）。关节内BSA注射后淋巴/骨髓细胞的分布为：40.9±19.93（淋巴样细胞%）和59.1±20.79（髓系细胞%）。一旦证明白细胞计数显著增加，在关节内BSA或PBS注射后第7, 14天和第21天进行滑膜淋巴细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞及其比值的分析。当关节内BSA注射后第7天定量测定滑膜淋巴细胞时，观察到显著差异。与基础值相比，预先免疫动物的BSA关节内给药使滑膜CD8+T细胞显著减少。与此相反，CD4+T细胞百分率以及CD4/CD8比值显著增加。PBS关节内注射预致敏的动物中，与基础值相比没有观察到显著差异。

 

BSA局部给药调节预致敏动物滑膜液的细胞因子谱：免疫动物的滑液仅检测到IL-12P40细胞因子的显著性差异。关节内BSA免疫后第7天IL-12P40有显著性差异，第14天无显著性差异（但呈上升趋势）。21天后观察无显著性差异。

 

关节镜检查在滑膜炎诊断中的应用：关节镜检查是在关节内BSA或PBS注射后第14天进行的。共进行8次关节镜评估。四个腕关节，其中BSA关节内注射显示略微红橙色。PBS注射的腕关节，显示清晰、无色或稻草色滑膜。

 

压力平台步态分析在滑膜炎监测中的应用：前肢BSA注入表现出巨大的个体间变异性，在垂直最大力方面没有显著差异。由于伦理和动物福利，这种运动分析必须在镇痛下进行。

 

结论：考虑到动物模型的建立是临床前研究的绝对先决条件，本文描述了一个临床相关的猪滑膜炎模型。这种抗原诱导的炎症模型引发的细胞介导的反应，使我们能够识别用于监测滑膜炎和新开发的治疗的生物标志物的免疫学参数。此外，抗原诱导滑膜炎模型也可以通过标准的关节镜器械和动力学研究来评估。