摘要：转移是一个重要的临床问题，其生物学尚未完全了解。活体成像是一种强大的技术，已经显示出极大的承诺，增加我们对事物发展的理解。迄今为止，大多数活体成像研究已经在小鼠中进行，其限制了它的采用。斑马鱼也是一种常用的活体转移显像系统。由于胚胎成像技术简单，使用成人斑马鱼研究转移的研究相对较少。随着时间的推移，没有人跟随转移细胞中的单个细胞。本研究的目的是证明成人斑马鱼模型，能随着时间的推移，以单细胞分辨率进行转移灶的活体成像。

 

方法：使用静脉注射方案将ZMEL1斑马鱼黑色素瘤细胞注射到6至10周龄的Casper鱼体内。因为Casper鱼是透明的，即使是成年人，它们也可以在没有手术干预的情况下成像。2周时间随访单个细胞伴随其被捕获，外渗，形成宏观转移。

 

结果：我们的注射方法可靠地将细胞送入循环，并导致在多个器官中形成肿瘤。用共聚焦显微镜可以在2周内以高分辨率成像皮肤和真皮肌肉中的细胞。捕获被可视化，并确定主要是由于大小限制。逮捕后，外渗发生在注射后1天和6天之间。一旦在血管外，观察到细胞迁移以及形成突起。

 

结论：Casper鱼是一个有用的模型，研究瘤的转移使用活体成像。

 

 

背景：转移是绝大多数癌症相关死亡的原因，但我们对潜在生物学的理解仍然不完整。在转移部位发生的事件（即捕获、外渗和生长成新的肿瘤）尤其难以理解。这些事件需要进一步阐明，因为它们可能是转移级联中的限速步骤，这一事实证明肿瘤可以每天将成千上万个细胞流到循环中，但只有很小的一部分会形成转移。肿瘤细胞、血小板、白细胞和内皮细胞之间的动态相互作用是调节转移形成的关键。虽然成像窗口允许研究活体小鼠的转移位点，但一些关键限制限制了它们的广泛应用。首先，实验中的每只动物都需要手术植入成像窗。准备每只动物所需的时间限制了实验中使用的数量。第二，熟练掌握手术技术所需的设备、专业知识和时间使得活体成像远不及常规技术。某些组织在成像窗口的安装之外还存在进一步的技术挑战。例如，肺是小鼠中研究得最好的转移部位之一。然而，肺成像需要额外的稳定技术来补偿呼吸运动，从而减少成像的持续时间。这些技术可以包括离体肺隔离或将肺粘附到成像窗体内以最小化其运动。与这些技术相关的额外挑战限制了小鼠肺部活体成像研究的数量。斑马鱼胚胎由于其光学透明性和在母体外的发育，已被广泛用作活体内转移显像的模型系统。此外，斑马鱼与人类有很大的同源性，约70%的人类基因在斑马鱼中具有可识别的同源性。最近发展的透明斑马鱼，Casper，为肿瘤和转移的活体显像提供成人模型。Casper鱼类携带两个纯合子突变，防止黑色素细胞和虹膜细胞的发育。没有这两种类型的色素细胞，斑马鱼即使是成人也透明，消除了实验之前对动物的任何进一步操纵的需要。Casper鱼类已被用来克隆克隆异质性和新生血管移植原发肿瘤。Casper鱼也被用作定量系统研究转移的荧光作为读出。此外，在肿瘤移植后的Casper鱼中也检测到了微转移。我们在这里描述了一种将肿瘤细胞静脉注射到年轻的Casper鱼中，这是目前用于成年动物注射方法的改进。然后，我们描述一个简单的协议，活体成像，并展示其效用通过表征在两个星期的过程中肿瘤细胞在转移部位的行为。

 

方法：斑马鱼养殖：斑马鱼饲养在28°C，14小时光照，10小时黑暗循环，每天喂三次盐水虾。

实验中，用斑马鱼肿瘤细胞注射的鱼单独放置在含有大约400ml水族馆补充水（AMW）的塑料杯中，并每天喂盐水虾一次。注射人肿瘤细胞的斑马鱼在玻璃瓶中以100mL的AMW保存在34℃水中，每天喂食一次。在实验之前，斑马鱼每天通过将水温提高1°C来适应温度升高。用于实验的年轻成年斑马鱼在6和10周龄之间，以每3 L罐的15条鱼的密度被容纳。在注射ZMEL1斑马鱼黑色素瘤细胞之前，明显小于鱼缸中大多数鱼的鱼没有注射。用GC 40Eγ辐照器，在注射前一天和两天，用两剂15Gy照射免疫活性Casper鱼。在注射人肿瘤细胞之前，在注射前1天和2天用15Gy或20Gy照射斑马鱼，或在注射前2天开始使用15μg/ml地塞米松。实验过程中胚胎保持在34度，涉及人类细胞。注射前16h在含80个胚胎的平皿中添加12ul的30 mg/ml链霉蛋白酶。

 

组织学：用0.1%丁卡因在冰上浸泡斑马鱼20分钟，使其安乐死。固定后，鱼在水中浸泡3小时，在Richard Allan脱钙溶液中浸泡16小时，脱钙。然后用水冲洗，乙醇脱水，石蜡包埋，切成5μm厚的切片。切片HE染色。

 

静脉、后眶、胚胎注射：用胰蛋白酶消化ZMEL1斑马鱼黑色素瘤细胞细胞，用4ml含血清培养基对胰蛋白酶进行淬灭。用PBS洗涤细胞2次，静脉注射5×105细胞/μL的无菌PBS或眼眶1×104细胞/1000μL的无菌PBS，胚胎（胚胎）4×104细胞/μL的无菌PBS.。如前所述，将1μL的细胞悬浮液逆向注入到每条鱼中。在静脉注射前，年轻的成年斑马鱼用0.017%三卡因麻醉，直到触觉迟钝。一旦麻醉，鱼被转移到一个干燥的10厘米平皿中注射。注射后，鱼被转移到AMW恢复。

 

共焦活体成像：在AMW中加入50 ppm丁香酚诱导麻醉。一旦鳃盖运动减慢，鱼被放置在一个6孔培养皿的一个孔中，使得后部位于孔的中心，头部靠在周围的塑料上。然后将鱼的后部加入2%的低熔点琼脂糖固定。少量的15 ppm丁香酚在AMW中滴加至鳃，以允许呼吸，而琼脂糖固化。琼脂糖固化后，在AMW中填充15 ppm丁香酚。每分钟监测鱼的鳃盖运动。如果停止，新鲜的AMW不添加丁香酚，直到鱼恢复。当鱼开始苏醒时，在AMW中加入50ppm丁香酚再诱导麻醉，然后用15ppm丁香酚维持麻醉。用NIKON A1R倒置共聚焦显微镜对鱼进行成像。

 

解剖显微镜成像：用0.017%三卡因麻醉，直到触觉迟钝。麻醉后鱼被转移到一个干燥的10厘米平皿中，鱼周围的区域被干燥，留下一个小的弯月面水覆盖鱼，以允许呼吸。使用徕卡M165FC解剖显微镜对鱼进行简单成像。

 

胚胎显像：96孔玻璃底板的每个孔填充60μl的2%琼脂糖。将3D打印针工具放入威尔斯中以产生用于将胚胎保持在侧向位置的模具。胚胎在0.017%的三卡因中被麻醉胚胎在尼康A1R倒置共聚焦显微镜上成像。

 

结果：逆行眶内注射是成年斑马鱼体内直接注射细胞或试剂的常用途径。这些注射在年轻成鱼（6至10周龄）中的效率很低，这是由注射后14天的动物后部肿瘤的百分比决定的。动物的后部被选择用于定量，因为所有注射导致注射部位的肿瘤，动物的前部，只有成功的注射扩散到后部。在透明Casper鱼中，主要的血管通过皮肤可见，允许直接静脉注射（IV）。选择注入普通的基底静脉，因为它是一个易于在解剖显微镜下定位的大目标。在6至10周龄的Casper鱼中，与普通眶静脉注射相比，静脉注射提供了更高的效率。开发了使用GFP标记的斑马鱼黑色素瘤细胞系（ZMEL1）的注射方案，选择这种细胞系，因为它是少数几种斑马鱼癌细胞系之一，其转移行为得到了很好的表征。注射成功后立即观察到GFP阳性细胞出现在鳃和鱼后部。注射后14天，在整个鱼中观察到肿瘤生长。鱼的组织学揭示了包括肾脏、皮肤、鳃、心脏、肠和肝脏在内的多个器官的肿瘤。

 

成年斑马鱼活体成像：把它们放在玻璃皿底中，用麻醉剂和低熔点琼脂糖固定在鱼身上进行活体成像。活体Casper鱼的脉管系统和肿瘤细胞可视化。共聚焦显微镜或200μm的双光子显微镜观察到这些脉管中的脉管深度为100μm。最佳成像位置被确定为仅在尾鳍附近的鱼后部脊椎侧的区域。该区域相对平坦，允许在单个焦平面上可见大面积。此外，这个区域距头部足够远，受鱼鳃盖运动的影响最小。ZMEL1细胞可在注射后不久的皮肤和皮下肌肉组织中观察到。在注射后的最初几个小时，观察到肿瘤细胞流经血管或稳定地被捕获。

 

转移部位研究：使用活体成像研究转移部位的早期（即转移、外渗和早期生长转移）。首先描述ZMEL1细胞在注射后第一小时内被捕的位置。观察到肿瘤细胞被逮捕在三类位置：弯曲，分支点，或两者都不是。当我们比较这三个位置的细胞的相对频率时，我们发现大多数（73%）肿瘤细胞在弯曲和分支点处被捕，其余27%在哪也不被逮捕。然后测量在血管中被捕的肿瘤细胞的直径，并发现其比邻近被逮捕的肿瘤细胞的血管中的最窄点大。这一结果表明，该系统中的肿瘤细胞一旦滞留在太小的血管中，它们就不能通过。ZMEL1细胞注射后，在指示的时间点对个体鱼成像。非侵入性的成像协议允许每个鱼重复成像没有任何明显的不良影响。在这个时间窗口中，通过将细胞评分为血管内、外渗或血管外，对外渗进行定量。在注射后24小时开始外渗，并在注射后72小时增加至峰值。注射后6天（DPI），所有剩余细胞均出现外渗或外渗过程。肿瘤细胞在转移部位的磨损与上述时间点相同。细胞数量被量化为细胞相对于第一时间点（注射后3小时）的分数。细胞数量最初下降，在注射后48小时达到稳定状态，此后细胞数目稳步增加直至实验结束。我们观察到许多血管外细胞在外渗后形成长突起。随着时间的推移，这些突起被观察到丢失。将我们的研究扩展到具有良好研究的体内转移表型的人类肿瘤细胞：MDA -MB-435黑色素瘤细胞系，LM2三阴性乳腺癌细胞系和MA2黑色素瘤细胞系。注射后，观察到一些细胞在注射后24小时外渗。然而，当相同的位置随时间成像时，在注射后2天内观察到MDA -B-435细胞和LM2细胞消失。我们怀疑这些细胞是由于免疫系统的清除而丢失的。我们利用辐射、地塞米松或两者联合检测了各种免疫抑制机制，这是基于先前报道的斑马鱼肿瘤异种移植成功的研究。，持续发展的免疫受损斑马鱼表明，这种限制可能是暂时的。结果可能是由于这些人类细胞系不能在斑马鱼中生长。LM2细胞由于其不能在斑马鱼中生长而丢失，但在成人中，MDA -MB 435和MA2细胞也不能移植的事实表明免疫排斥仍然是成功移植的主要障碍。

 

转移瘤的研究进展：选择2周作为这些研究的终点，因为ZMEL1肿瘤生长迅速，在这个时间点之后很难区分个体转移。在注射后4周内，转移将继续生长，此时鱼开始看起来不健康，必须按照动物福利指南进行安乐死。在进行成像的鱼的区域中，在肌肉节段之间有规则的间隔看到大血管。在注射后不久，发现含有被捕的肿瘤细胞的鱼的区域。然后在单一时间点上对这些区域进行成像，播散的肿瘤细胞生长成大的转移灶。外渗后，细胞相当于迁移。在注射后第2天和第4天，细胞很少停留在同一位置。细胞在6小时内观察到高度迁移。为了测试斑马鱼第9天ZMEL1肿瘤是否迁移，注射转移瘤9天后在6 h内每3小时成像一次转移瘤。在这个时间间隔，观察到最小的迁移。然而，细胞通过伸长和缩回突起而广泛地改变形状。

 

结论：研究活体成像的转移部位，成人Casper鱼是一个有用的系统。首次报道了一种有效的在年轻斑马鱼体内注射细胞的方法。在2周的研究过程中，使用活体成像来跟踪转移部位的肿瘤细胞。鉴于斑马鱼的低成本和方法的简单性，它们提供增加活体成像的机会。