摘要：年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人致盲的主要原因。玻璃膜疣的出现是临床表现，是渗出性和萎缩性AMD的先兆。近来，基于抗体的药物已被用于治疗渗出型。然而，它们不能恢复患者良好的视力。此外，对于萎缩性AMD尚无有效的治疗方法。我们创造了小的化学物质，作为细胞内的ATP调节剂。在本研究中，我们研究了KUS121在C-C趋化因子受体2型缺陷小鼠（AMD小鼠模型）中的体内功效。全身给药KUS121预防或减少玻璃膜疣样病变和内质网应激，然后基本上减轻脉络膜视网膜病变，显著保留视觉功能。实验证实玻璃膜疣影响的猴长期口服KUS121不引起系统并发症。KUS对ATP的调节可能是治疗DD和预防AMD疾病进展的一种新策略。

 

 

简介：年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种眼部疾病，其主要临床表现为中央视力的渐进性丢失。AMD是一种多因素的疾病，主要的危险因素是衰老，尽管遗传易感性和环境因素也影响疾病的发病和发展。就潜在的疾病机制而言，内质网（ER）应激导致视网膜色素上皮（RPE）的功能丧失和随后的视网膜神经细胞死亡。晚期AMD分为渗出性和萎缩性AMD两种类型，以病理学为基础。渗出型的特征是新产生的脆弱的脉络膜新生血管。因此，常伴有视网膜水肿、视网膜下积液，甚至伴有晚期出血。这些症状直接或间接损害黄斑的功能，即中央视力。不管晚期AMD的类型如何，常被称为玻璃膜疣的特征性沉积物在AMD的早期或甚至临床前阶段中经常被观察到。这些是RPE和Bruch膜之间脂蛋白的胞外积累。另外，在早期和中期AMD患者中，有50%例出现"视网膜样沉积物"-另一种类型的视网膜下积聚。值得注意的是，大约55%的视网膜下类尘螨沉积患者可能会出现渗出性或萎缩型晚期AMD。为了治疗渗出型的晚期AMD，已经使用了基于抗体的药物（例如抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体）。这些药物导致新血管血管渗出性病变的暂时性改善。然而，一旦视网膜中央凹的感光细胞和视网膜色素上皮细胞受到新生血管的损害，视觉预后通常较差，即使积极治疗。另一方面，目前还没有治疗萎缩性AMD的方法。为了获得更好的视觉预后或阻止进展到晚期AMD，一种新的策略，针对疾病的早期阶段，如改善RPE功能或玻璃膜疣清除治疗。Valin蛋白是一种广泛存在于神经退行性变和生理活动中的ATP酶。最近，我们开发了新的化合物，其特异性地抑制VCP的ATP酶活性而不影响其细胞功能。我们把这些化学物质称为(KUSs)。KUSs可维持细胞ATP水平，从而起到ATP调节作用，从而在体内和多种病理条件下抑制内质网（ER）应激和细胞死亡。事实上，KUSs已经被证明在视网膜色素变性、青光眼和视网膜缺血动物模型中减轻视网膜病理。KUSs抑制视网膜细胞ATP的减少和细胞死亡，我们决定测试这些化合物是否能抑制AMD动物模型中涉及RPE的病理学。

虽然没有动物模型复制AMD所有相关性状。C-C趋化因子受体2型（CCR2）缺陷小鼠已被报道能模拟早期和晚期AMD的脉络膜视网膜病变。在本研究中，我们对CCR2缺陷小鼠和玻璃膜疣食蟹猴给予KUS121，KUSs之一，我们调查该化合物是否影响动物的病理。

 

CCR2缺陷小鼠的实验研究：为了增强视网膜色素上皮和脉络膜的免疫组化分析，在CCR2缺陷小鼠的视网膜中，我们反复地用白化病小鼠回交CCR2缺陷的小鼠，直到失去黑色素。环境保持在1 4/ 10h的光暗周期。所有小鼠均自由采食。在采集眼底图像或视网膜电图之前，肌肉注射氯胺酮（70 mg/kg）/甲苯噻嗪（14 mg/kg）混合物麻醉小鼠。用托吡卡胺和去氧肾上腺素（0.5%个）滴眼液将瞳孔扩张至直径约2毫米。

 

KUS121在CCR2缺陷小鼠中的应用：六月龄的CCR2缺陷小鼠被分为KUS121治疗组（n＝15）或对照组（n＝11）。KUS121治疗组的小鼠自由采食含384.5 mg/L KUS121的水，对照组9个月至15个月时无需KUS121饮水。在评估视觉功能的实验中，被分配给KUS121治疗组（n＝12）的CCR2缺陷小鼠在2个月至9个月的时间内口服KUS121；他们也随意地获得含有384.5 mg/L的KUS121的水。给予对照组（n＝15）的CCR2缺陷小鼠口服给药（含5%克雷莫福的/磷酸盐缓冲盐水）。

 

CCR2缺陷小鼠的眼科评价：在每个评价点进行以眼底为中心的彩色眼底照相并聚焦于深视网膜和视网膜色素上皮层。在每个评价点，用掩蔽评估器手动计数圆形黄斑病变的数目三次，然后对平均值进行分析。使用9个月大的CCR2缺陷小鼠进行暗视觉视网膜电图。小鼠麻醉前整夜暗适应。用一个发光二极管的金环角膜电极记录视网膜电图。将参考电极置于口中，将接地电极插入肛门。用0.3～500 Hz的带通滤波器对10 kHz的视网膜电图响应信号进行放大，并使用PrimeLablab 2/25进行分析。

 

CCR2缺陷小鼠的组织学研究：在最后评价点进行眼科检查后，用戊巴比妥过量给小鼠安乐死，眼球摘除。在4℃下将眼用4%聚甲醛固定24小时，然后加入石蜡中。石蜡切片连续切割6μm。选择视网膜切片用HE染色。用抗CHOP抗体进行免疫染色。然后他们在显微镜下拍照。

 

食蟹猴实验研究：本实验采用两只年轻（7岁和8岁）和三只老年（23, 23，26岁）黄斑区有玻璃膜疣的食蟹猴。所有五只猴子在开始时口服KUS121，10μg/kg/天（每天两次）。在眼科检查前20分钟，每动物滴注一滴托吡卡胺，使瞳孔扩大。然后用肌肉注射10毫克/千克氯胺酮麻醉猴子。每只猴子中，使用数字眼底照相机在基线和给药后3, 6，9个月获得数字化的眼底照片。对于黄斑区的形态和功能评价，SD-OCT和局灶视网膜电图也在给药开始后3个月和6个月进行。在聚焦视网膜电图记录中，瞳孔最大扩张后，在结膜囊中放置Burian Allen双极隐形眼镜电极。氯化银电极被连接到左耳垂作为接地电极。15°圆形刺激定位于视网膜中央凹，诱发局灶性视网膜电图。白色刺激光和背景光的亮度分别为181.5和6.9 CD/m2。45°视角的背景场从眼底照相机投射到眼睛上。用2Hz矩形刺激记录病灶视网膜电图。

 

结果：KUS121预防CCR2缺陷小鼠眼底黄斑病变的增加：老年CCR2缺陷小鼠的彩色眼底照相通常显示圆形黄斑病变，每个大小大约为1/4个椎间盘直径，并且在RPE水平上能清楚地看到。分段谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）图像在感光层外板上总是表现出中等的高反射率。这种高反射率常常使得难以准确地鉴别哪些视网膜部位对应于眼底摄影中出现的圆形黄斑病变。然而，SD-OCT偶尔也会在感光体和RPE层中表现出凸起，可能与圆形黄斑病变相对应。用彩色眼底照相进行纵向观察显示，圆形黄斑病变随着年龄的增长而扩张并有时合并，并且这种发展伴随着退行性改变。我们研究了KUS121对圆形黄斑病变的影响。我们将CCR2缺陷小鼠分为两组：未接受治疗的对照组和KUS121治疗组（分别为11只和15只小鼠）。6个月和9个月（治疗开始时），各组间黄斑病变的数目无显著差异。对照组的圆形病变随年龄增加而增加，但KUS121治疗组则无变化或仅轻微增加。KUS121治疗组在10个月龄后黄斑病变明显少于对照组。在KUS121治疗组的四只小鼠中，黄斑病变在实验期间明显减少，在这些小鼠中没有发生退行性改变。

 

KUS121减轻CCR2缺陷小鼠的年龄依赖性脉络膜视网膜病变：为了研究KUS121对CCR2缺陷小鼠脉络膜视网膜病理的影响，我们对小鼠视网膜切片进行形态学分析。15个月大的野生型小鼠HE染色切片显示在感光体和RPE层中良好的组织微结构。相反，来自对照年龄匹配的CCR2缺陷小鼠（对照）的切片显示RPE细胞中广泛的空泡化。在年龄匹配的CCR2缺陷小鼠用KUS121治疗后，RPE细胞中的空泡化少得多。野生型小鼠的TEM图像显示在视网膜色素上皮基底侧没有任何沉积的生理性皱褶。相反，CCR2缺陷的对照小鼠在RPE内层的间隙内表现出丰富的基底层层沉积。这些沉积物与眼底彩色照片中的圆形黄色病变相对应。然而，在KUS121处理的CCR2缺陷小鼠中，在基底膜侧很少观察到这样的基底层沉积。

 

KUS121保留CCR2缺陷小鼠的视觉功能：为了研究KuS121对CCR2缺陷小鼠视网膜功能的影响，我们用暗视视网膜电图对这些小鼠进行了分组，并对其进行了检测。在用KUS121治疗9个月大的CCR2缺陷小鼠7个月，杆状反应的B波振幅显著大于未处理的CCR2缺陷小鼠的B波振幅。在KUS121处理的CCR2缺陷小鼠中，锥体和棒状反应的A波振幅也显著大于未经处理的小鼠的A波振幅。

 

KUS121预防老年CCR2缺陷小鼠视网膜和脉络膜的慢性ER应激：KUS能抑制视网膜色素变性和青光眼小鼠视网膜中的ER应激。我们接下来研究了KUS121对CCR2缺陷小鼠ER应激的影响。我们收集了来自15个月大的CCR2缺陷型或野生型小鼠的RPE和脉络膜的组织混合物，并用免疫印迹评估ER应激。在KUS121处理的CCR2缺陷小鼠中，CHOP的表达水平在15个月龄时显著低于对照组。CCR2缺陷型白化病小鼠（对照组）脉络膜视网膜组织的免疫组织化学研究显示，CHOP染色不仅依赖于脉络膜和RPE，而且在视网膜内表现出年龄依赖性的增加。在年龄匹配的CKS121处理的CCR2缺陷白化病小鼠中，在2个月龄开始治疗，CHOP染色是微弱的，这表明KUS121已经强烈地抑制了CCR2缺陷小鼠的脉络膜视网膜组织中慢性年龄诱导的ER应激。

 

KUS121对食蟹猴玻璃膜疣的治疗作用：在SD-OCT切片上有代表性的玻璃膜疣表现出中度的超反射材料，同时伴有RPE和感光层的鼓胀。这类似于AMD的视网膜下虹膜沉积。这些食蟹猴玻璃膜疣在组织学上观察到Bruch膜上的亚RPE沉积物，其与曙红均匀染色。玻璃膜疣内部的超显微结构包含许多圆形的油滴状材料。五只猴每天服用10毫克/公斤/天的KUS121。在KUS121给药开始三个月后，三只猴子（7, 23，26岁）黄斑疣的数量与基线相比没有变化。然而，两只猴子（分别为8岁和23岁）玻璃膜疣似乎略有下降。在这两只猴子中，KUS121的剂量从10个月提高到20毫克/千克/天，从5个月起直到最终评价点（开始给药后9个月）。我们还制作了所有五只猴子的主要器官（脑、肺、肝、胃肠道、肾脏和生殖器）的组织切片。所有检查均无明显异常，提示KUS121无不良反应。

 

结论：萎缩性AMD没有建立有前途的治疗方法，尽管许多试验包括靶向补体系统和干细胞治疗。因此，KUS121是代替神经营养因子、视觉周期调节剂、抗氧化剂和抗炎治疗，治疗玻璃膜疣和预防AMD晚期脉络膜视网膜萎缩的一种有前途的新方法。