摘要：我们正在使用遗传学来识别特异性地参与听觉再生的基因。在大规模的遗传筛选中，我们鉴定了N-糖基化生物合成途径中的一个基因Mgat5a，其活性对毛细胞再生有负面影响。

 

方法：我们使用斑马鱼突变体分析和毛发细胞再生试验相结合的方法来鉴定斑马鱼中Mgat5a活性的丧失。使用药物抑制N-糖基化，还使用过表达分析的mRNA注射，以证明N-糖基化的变化如何改变细胞信号转导。

 

结果：发现Mgat5a在斑马鱼胚胎发育过程中在多个组织中表达，特别是富集在神经组织中，包括脑、视网膜和侧线神经母细胞。Mgat5a插入突变和CRISPR/CAS9生成的截短突变均导致毛细胞再生的增强，这可能是通过天鹅星碱的药理抑制而引起的。除毛细胞再生外，N-糖基化途径的抑制也增强了侧线轴突和尾鳍的再生。进一步的分析表明，N-糖基化改变了TGF-β信号的反应性。

 

结论：本研究结果为N-糖基化在组织再生和细胞信号转导中的参与提供了实验依据。

 

 

背景：Glycans与核酸、蛋白质和脂类一起构成细胞的四个主要组分。聚糖具有很大的结构复杂性，并且在不同的细胞类型中有很大的多样性，从而提供具有不同功能特性的细胞。由于在不同糖形式的检测和表征方面的技术挑战，聚糖研究通常落后于基因组和蛋白质组学方法。糖基化改变的生物学后果仍然是生物医学研究的一个关键但具有挑战性的领域。糖基化蛋白是细胞中聚糖结合物的一种重要形式。聚糖可在多种蛋白质上发现，从分泌的胞外蛋白到膜受体，到胞浆蛋白。糖基化在这些蛋白质上提供了调节细胞内信号和细胞间通讯的潜力。有两种主要的蛋白质糖基化方式，N-糖基化加糖在天冬酰胺的氮上。O-糖基化加糖到丝氨酸或苏氨酸残基氧上。很明显，一个单一的蛋白质可以通过一个或多个糖基化形式在多个残基上糖基化。创伤性损伤后的组织再生是一个复杂的分子信号和细胞-细胞相互作用的过程。由于哺乳动物具有相对有限的再生潜力，许多非哺乳类脊椎动物模型，包括斑马鱼，已经被用来研究组织再生的分子机制，如心脏、肝脏和毛细胞（听力）。研究已经证明了大量的蛋白质和相关的信号通路在组织再生过程中的重要参与，然而，在这一过程中蛋白质糖基化的贡献仍在研究中。在斑马鱼毛细胞再生相关基因的遗传筛选中，我们鉴定了Mgat5a作为再生反应的调节剂。MGAT5A基因在所有脊椎动物中高度保守。它编码β1，6- N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V酶，在N-糖基化途径中的内侧高尔基酶催化B1,6GLCNAC-分支N-糖基化合成到各种蛋白质缀合物。以前的报道表明Mgat5a在肿瘤转移、细胞增殖和免疫细胞活化中起着重要作用。本研究对Mgat5a转录因子在胚胎发育过程中的时空分布进行了研究，探讨了Mgat5a和N-糖基化途径在损伤诱导组织再生中的作用。

 

结果：Mgat5a- RFP插入突变促进毛细胞再生：为了鉴定涉及听觉再生的关键基因和途径，我们进行了大规模的靶向诱变和遗传筛选，以确定斑马鱼侧线毛细胞再生所必需的基因。我们对成年斑马鱼的感觉上皮进行了转录谱分析，结果表明：使用聚集的间隔间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（CAS9）来靶向基因或DNA整合，然后对纯合子进行近交检验，将毛细胞暴露于硫酸铜 1小时后检测再生。染毒后48小时计数毛细胞。在分析Mgat5a MN0157GT突变的基础上，确定了Mgat5a作为再生反应的调节因子。Mgat5a MN0157GT通过插入Mgat5a基因内含子10中的基因诱捕转座子而产生，并在N端产生具有截短Mgat5a蛋白和C末端的红色荧光蛋白（RFP）的融合蛋白。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析两个引物构建的基因陷阱整合区显示，突变株Mgat5a野生型mRNA显著减少，但残留表达，表明Mgat5a MN0157GT是一个亚型等位基因。Mgat5a基因MN0157GT突变对毛细胞发育无影响。时间进程分析表明，突变体的毛细胞再生在消融后2天（DPA）得到增强，但与3 DPA的对照相比，表明它不是"过度生长"表型。在Mgat5a MN0157GT突变体中没有观察到额外的表型。

 

Mgat5a在神经母细胞毛细胞和支持细胞中表达，而不是在外套膜细胞中表达：通过可视化Mgat5a MN0157GT突变体中的RFP，我们研究了Mgat5a在斑马鱼胚胎中的定位。显微镜检查显示，RFP存在于斑马鱼的前侧和外侧线神经母细胞，斑马鱼的另一种毛细胞。共聚焦分析表明，Mgat5a RFP融合蛋白在整个颗粒细胞中以一定颗粒形式表达。粒化分布与野生型Mgat5a蛋白的高尔基体定位一致。为了鉴定神经母细胞表达Mgat5a的细胞类型，我们首先用ET（TNK1BP1:EGFP）越过Mgat5a MN0157GT线。其中TNK1BP1启动子在支持细胞中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）。双转基因胚胎在神经嵴的某些区域显示颗粒状共定位荧光，表明支持细胞中GFP和RFP的表达。双转基因胚胎在一些GFP排除区也显示颗粒RFP，表明Mgat5a在毛细胞中的表达。有趣的是，大多数RFP表达通常不直接与GFP共定位，即使在相同的细胞中表达。我们相信，这是因为Mgat5a酶被隔离在高尔基体中，GFP表达是在细胞质的。为了进一步验证Mgat5a在毛细胞中的存在，我们用耳毒性化学铜消融毛细胞，然后检测GFP和RFP的表达水平。铜暴露后，所有细胞均表达GFP和RFP，表明GFP阴性、RFP阳性细胞为毛细胞。发现所获得的双转基因胚胎将RFP和GFP蛋白分配到不同的神经支配区域，Mgat5a RFP在神经轴突（支持细胞）的内环和ET20：EGFP主要位于神经肥大细胞（外套膜细胞）的周围，并且没有显著的重叠。这种分布模式表明Mgat5a不在地幔细胞中表达。

 

Mgat5a在斑马鱼胚胎发育过程中的神经组织表达：Mgat5a基因在脊椎动物（包括斑马鱼、小鼠和人类）中是保守的。为了研究Mgat5a在斑马鱼胚胎发育中的作用，我们进行了全套原位杂交（WITE）分析，以研究Mgat5a转录本在胚胎组织中的空间温度定位。发现Mgat5a在四个细胞阶段强烈表达。在受精后14 h，背侧中线Mgat5a表达量明显增加，1 dPF中Mgat5a在脑中广泛表达，在5 DPF中的脑表达持续存在，在肠、脊髓和侧脑脊液中也检测到表达。原位染色5天龄胚胎组织切片显示Mgat5a在多个器官中的表达增加。它在许多视网膜组织中高表达，包括视神经和内、外丛状层。切片显示，在整个脑区、内耳嵴和脊髓中存在高水平的Mgat5a转录。组织切片分析还显示Mgat5a表达在神经瘤中分布不均匀，支持其在神经肥大细胞亚群中的表达。此外，Mgat5a在肠内富集，这是一种已知糖基化酶活性高的器官。

 

Mgat5a缺失突变促进毛细胞再生：为了验证Mgat5a在毛细胞再生中的作用，我们使用CRISPR/CAS9诱变来建立Mgat5a基因的插入/缺失突变。第3外显子1或第10外显子2的小的吲哚突变对毛发细胞发育或再生没有影响。RT-PCR分析表明，缺失突变体产生的Mgat5amRNA截短，其表达水平高于对照组的野生型Mgat5a mRNA。缺失突变体对毛发细胞发育没有影响，但与基因捕获基因Mgat5a MN0157GT相似，显示可检测到2 DPA的毛细胞再生增强。

 

N-糖基化途径中其它基因的CRISPR突变对毛细胞再生无影响：Mgat5a是N-糖基化途径中的一个组成部分。研究其他组分在毛发细胞再生中N-糖基化途径中的作用，我们使用CRISPR/CAS9靶向突变11个在N-糖基化途径的不同步骤发挥作用的其他基因。发现突变基因中没有一个突变对毛细胞再生有影响。还发现在突变的Mgat5b中没有发现毛细胞再生的改变。

 

N-糖基化途径对毛细胞再生的抑制作用：Mgat5a MN0157GT插入突变体和Mgat5a HG29缺失突变体在野生型或截短形式中都有相当大的mRNA表达，提示这两种突变都是亚型的。为了研究N-糖基化途径的功能丧失对毛细胞再生的影响，针对不同的途径步骤我们使用两种药物抑制剂苦马豆素（SW）和1-脱氧野尻霉素（DNJ）。DNJ的溶解度很差，只有250μm的浓度才有显著的效果。SW促进了毛细胞在几种浓度下的再生。5μg/ml的SW可显著促进毛细胞再生，但SW浓度增加（25或50μg/ml）并没有显著差异，提示5μg/ml SW具有完全抑制作用。由于SW对毛细胞再生的影响大于DNJ和两个MGAT5A的亚型突变，因此进一步研究了N-糖基化在其他组织再生中的作用。

 

N-糖基化途径的抑制增强侧线轴突和尾鳍的再生：由于Mgat5a在多个组织中表达，N-糖基化影响许多生物过程，所以我们假设阻断N-糖基化会影响不同形式的再生。我们首先研究了SW对侧线轴突再生的影响。侧线轴突是斑马鱼外周神经系统的重要组成部分，支配侧线神经系统。除毛细胞再生外，SW处理可显著促进激光损伤侧索轴突再生。还研究了SW对尾鳍再生的影响，这是一个涉及多种组织类型再生的过程，发现SW显著促进尾鳍再生。

 

N-糖基化途径的抑制降低了对TGF-β拮抗剂的反应性：体外研究表明，N-糖基化通过改变TGF-β配体的反应性影响TGF-β信号转导。为了测试SW是否通过改变TGF-β信号通路在体内影响组织再生，我们研究了两种TGF-β/节配体配体合成mRNA的胚胎的形态学表型：在存在或不存在SW的情况下。SW的存在显著降低了胚胎对左旋拮抗剂LeTyl mRNA的反应性。然而，SW对注射编码斜视的mRNA的胚胎没有明显的影响，即结节激动剂。数据表明，SW处理的胚胎更能抵抗节淋巴信号的减少，提示SW处理的胚胎中TGF-β信号的潜在上调。

 

结论：研究表明Mgat5a在调节多个组织再生中发挥作用，提出N-糖基化作为组织再生的潜在治疗靶点。还表明糖基化的改变可以改变细胞信号在某些途径的敏感性。