背景：心血管疾病仍然是现代药物研发的主要挑战。这些疾病是慢性的、复杂的，是遗传和环境之间复杂的相互作用的结果，涉及多种细胞类型和大量的系统因素。临床事件往往是突然的，疾病可能是无症状的。靶点选择通常基于有限的信息，尽管在筛选过程中经常发现高度特异性的药物，但其最终疗效往往受到未预料到的全身反应、狭窄的治疗指标或实质毒性的影响。在过去的2年中，我们对心血管疾病复杂程度的了解有了显著的增长，潜在疾病机制的范围包括先前认为仅涉及心脏或血管疾病的途径。大多数活性心血管药物来源于极少数类药物，并且靶向非常有限。这些药物通常最初用于特定的适应症，然后偶然发现在其他心脏疾病中具有疗效，或者以与其原始的作用机制无关的方式。在这篇综述中，描述了体内筛选的原理，并讨论了斑马鱼用于这种方法和功能基因组学中互补性工作的效用。还描述了在该设置中的模型的局限性以及在新疾病区域中需要仔细验证的必要性。综述了大多数临床心血管疾病的复杂机制，并提供了作为药物靶标的单一下游途径的局限性的见解。斑马鱼是一种模式生物，特别是心血管生物学。讨论了克服复杂生物学中药物发现障碍的潜在方法，包括斑马鱼遗传疾病模型的体内筛选。

 

 

简介：在哺乳动物中筛选的有限的可行性和成本已经允许这种方法只在药物发现的后期阶段来区分少量化合物。更易处理的模型，如酵母、秀丽隐杆线虫和果蝇，在代表心力衰竭或心律失常等表型方面没有足够的代表性，但这些模型已经成功地应用于其他疾病领域。在过去的十年中，斑马鱼作为可筛选脊椎动物模型的出现改变了遗传研究的规模，这对于复杂疾病是可行的。在受精48小时内，仔鱼已经建立了复杂的生理学，但可以在多孔板中大量持续数天，并且适合于遗传和化学筛选。斑马鱼基因组已被测序并易于使用吗啉反义寡核苷酸操作。使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶，基因簇敲除已经成为可行的，现在聚集有规则间隔的短回文重复/CAS9基因组编辑技术。已经成功地完成了形态学表型的饱和筛选，并且已经开始出现更复杂的生理和药理学特性。胚胎可以容易地排列在多孔板中，斑马鱼幼虫对小分子的通透性促进了特定途径修饰剂的化学筛选或抑制已在生物体内模拟的疾病特征。斑马鱼也正在开发成为毒物学的工具，并且这些端点可以与正在进行的发现努力并行筛选，甚至进一步利用完整的有机体超越目标器官系统的代表性。现有药物结合新的药物使药物与药物相互作用的筛选，而自交系允许罕见的基因-药物相互作用的筛选。

 

斑马鱼与心血管疾病模型：已经开发了用于测量斑马鱼中高吞吐量的心率、收缩力和血流的技术，以及二次化验的方法，，包括光电压映射、Ca2+成像和亚细胞Ca2+室的特异性转基因通讯员、离散信号传导器，甚至细胞器功能。有可能建立转录事件，允许定量评估体内可能通过其他途径无法访问的通路的活性。在早期的工作中，有可能显示超过90%的药物在人类中引起复极毒性，即使在受精后48小时，在斑马鱼中也产生同源的电生理效应。. 使用图像分析来探索心脏毒性的初始心率测定基于心率的主要频率成分，除了灵敏度和吞吐率的特异性。心律失常的复杂性表明，更复杂的建模是必要的，以充分了解潜在的生物学。为了使遗传或化学修饰剂能够进行机械评估，开发了一种利用电压敏感染料在一个阶段用光学作图直接测量斑马鱼胚胎的心脏动作电位的方法，在鱼适合于可扩展筛选的阶段。正常胚胎显示心房和心室动作电位分布的细微差异，正如预期的那样，这些在48小时左右的受精中显著地代表了成人心脏电生理学。收缩性和血管反应的类似研究也显著地反映了人类的大部分生理学。然而，确保特定研究所选择的端点对于筛选的总体目标是有效的始终是至关重要的。每一个被开发的分析都有严格的验证，最好是在感兴趣的疾病的遗传模型中。例如，斑马鱼的电生理终点在对1种形式的人类心律失常、遗传性复极扰动或长QT综合征的综合研究中被证实，使用斑马鱼突变体突变，其在心脏KCNH2基因中携带错义突变。在生理和疾病状态下建立了模型的保真度之后，就有可能利用斑马鱼模型系统的吞吐量进行插入斑马鱼突变体库的药物学筛选。这是为了以无偏见的方式识别新的基因来改变IKR阻断的心脏反应。尽管付出了巨大努力，但迄今为止还没有发现与生物学相关的复极或药物反应修饰位点。斑马鱼与人心脏复极之间的强健平行表明，这种临床上重要的复杂性状的正式遗传分析可能是可行的。为了优化灵敏度、特异性和吞吐量，将多非利特的异常心率响应的初始高通量筛选与第二高分辨率分析相结合，其中使用光学图谱研究证实突变体。后续测试允许纯药物反应表型与固有心率缺陷之间的区分。在340个插入突变体的初始货架筛选中，鉴定了15个对复极化有重要影响的基因，其中没有一个在这一过程中有牵连。有趣的是，这些基因中的大多数似乎属于整合素相关的调控通道及其衔接蛋白的网络。这些发现提示了机械负荷条件、炎症和复极之间的潜在联系，这可能在许多条件下对心律失常产生作用。在进行高通量筛选发现之前，该模型的建模、化验定义、化验验证和随后的筛选是至关重要的，其中任何化验的敏感性和特异性受到质疑。在进行这些步骤之前，充分理解筛选的限制，在总体设计中减轻任何混杂因素是可行的。可以引入预先指定的复制步骤，或者可以单独地组合各个检测以优化整体筛选的灵敏度和特异性。

 

斑马鱼心血管化合物的筛选：在心血管疾病中，无偏见的活体筛选已经开始在不同的疾病模式中实现，包括心律失常、心力衰竭和心脏毒性。利用人类ECT-A GO-GO钾通道（KCNH2）的斑马鱼直系同源物中的可行突变体，milan组研究人员进行了一个令人印象深刻的筛选，以寻找能够抑制合成的复杂表型的小分子。在48小时内测试1200种化合物，通过在96孔格式的72小时内对典型的2:1房室传导阻滞进行评分，他们鉴定了2种新的化合物，完全抑制了3条鱼中3个长QT表型，并被认为是命中。在一个强壮的斑马鱼模型中，心律失常性心肌病Nax's病，这是由PLACK基因突变引起的，它可以识别突变的鱼膜中的心率异常、收缩性和钠通道电导减少。然而，这些表型出现在受精后5天以上，对于高效筛选来说为时过晚。突变体和野生型兄弟姐妹的表达谱显示突变体与野生型同胞相比，NPPB转录水平显著升高，因此，NPPB:：荧光素酶报告线被交叉到Primkin突变体背景中。随后的筛选鉴定出一种化合物（Sb217639），其不仅在原突变系中具有纳摩尔活性，而且在致心律失常性心肌病的斑马鱼模型中也具有纳米活性。有趣的是，该化合物在由细胞骨架基因突变、核纤层蛋白或代谢参数引起的心肌病的突变模型中没有活性，当原发性心肌损害变少时，使用较少的定量终点是可行的，一些非常成功的筛选已经非常有效地使用快速视觉评估作为初始筛选。

 

结论：忠实疾病模型的体内筛选允许药物对整合生理和疾病生物学的影响在筛选过程中被捕获，对潜在的药物靶点不可知。这种系统的策略绕过了我们对疾病生物学的认识上的空白，但强调了基础疾病模型的严谨性的重要性。模拟斑马鱼心血管疾病的遗传或环境原因，使下游生物研究在规模上，结合互补模型系统有力地改变精确医学的多个方面。