摘要：目的：用斑马鱼模型直观地评价马钱子急性器官毒性。

 

方法：为评估急性毒性，我们初步确定马钱子给药24 h后的致死浓度。斑马鱼用五种小于等于LC10浓度处理24 h，观察马钱子对心脏形态、功能、中枢神经系统、肝、肾和器官特异性细胞死亡的影响。接下来，评估了毒性效应的可逆性。

 

结果：马钱子对斑马鱼的不同器官有影响，包括心脏、中枢神经系统、肝脏和肾脏。马钱子诱导的毒性作用在一定程度上是可逆的。

 

结论：斑马鱼模型适合于确定中药的毒性靶器官。

 

 

简介：马钱子具有悠久的使用历史，被广泛用于给药各种疾病，包括类风湿性关节炎和关节痛。它具有给药肿胀、炎症、兴奋中枢神经系统和减轻疼痛的作用。然而，它的给药使用常常受到其毒性强等问题的阻碍。因此，有必要加强马钱子配伍的研究，探索马钱子的有效配伍，降低其毒性，提高其功效。已经广泛证明斑马鱼是一种廉价且可替代的模型，用于快速评价候选药物的潜在毒性，因为它与哺乳动物和人类共享生理、形态学和组织学的相似性。斑马鱼与人的基因同源性高达85%。在信号转导途径和蛋白质水平上，功能域是高度保守的或结构上相同的。与传统的小鼠体内模型和体外细胞培养模型相比，透明斑马鱼胚胎在显微镜下可以观察到多个器官，为评估各种发育事件的药物效应提供了独特的优势。药效学、药代动力学和代谢物活性可容易评价。低成本、短周期、更少的试验化合物和高通量也使其成为研究开发毒性、致畸性、心血管毒性、肝毒性、行为毒性、肾毒性和一系列评价试验的使用模型。本研究以斑马鱼为研究对象，评价了马钱子诱导的急性毒性和器官毒性。斑马鱼模型被认为是一种替代或甚至更好的预测毒性模型。

 

材料和方法：饲养水（0.137 mol/L NaCl、5.4 mmol/LKCl、0.25 mmol/L Na2HPO4、0.44 mmol/L K2HPO4、1.3 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgSO4、4.2 mmol/L NaHCO3（pH 7～7.2，电导率500～750μs/cm））中，水温28.5°C。死的和未受精的胚胎被去除。由于胚胎从卵黄囊中获得营养，受精后7天内不需要喂食。干燥的马钱子提取物被保存在干燥器中直到使用。在随后的生物测定之前，将全部提取物用饲养水重新溶解解（400μg/ml），然后稀释至工作浓度。

 

给药：斑马鱼的不同器官在不同时期形成。为了确保药物致死性和急性毒性的可比性，对受精后2天的胚胎给药24h后评估中枢神经系统（CNS）和心脏。对受精后4天的胚胎给药24h后评估肝脏和肾脏。每个浓度，20斑马鱼分布在24孔板中，其中含有2毫升无菌鱼水，每孔两个幼虫鱼。在胚胎早期，保护性绒毛膜，可能会干扰药物吸收。为促进药物输送，受精后2天的斑马鱼在室温下用0.5 mg/ml蛋白酶溶液进处理15min。然后将2-DPF或4-DPF斑马鱼与药物孵育24小时。对于每个实验，未经处理的斑马鱼被用作测定对照。如果未处理的对照组中有10%的胚胎死亡或畸形，实验被认为是无效的。

 

致死性评估：为了评估致死性，最初测试了10种浓度：0.01、0.5、0.1、0.5、1, 5, 10、50, 100和400μg/ml。在初步实验的基础上，最终建立了六个浓度。为了建立致死曲线，在处理24小时后，对暴露于不同浓度的斑马鱼存活数进行计数，死亡的胚胎被移除，因为死斑马鱼会崩解，阻碍计数。实验进行三次。分析计算LC50和LC10。

 

器官形态/功能毒性评价：六种小于等于LC10的药物浓度，在致死性研究中测定，用于评估器官特异性毒性。如上所述进行药物给药。在评估心率和循环后，用M3-氨基苯甲酸乙酯麻醉斑马鱼，并使用立体显微镜进行视觉评估。百分之三的甲基纤维素用于固定斑马鱼以促进成像。器官形态或功能毒性的终点不同。异常心率、心动过速、心律失常、异常循环、心包水肿、心室形态异常等为心脏毒性评价标准，畸形脑为中枢神经系统毒性。肝脏大小和颜色是肝毒性，肾周围积液，囊肿形成，或躯干水肿是肾毒性。

 

给药24h后细胞死亡评估：实验结束后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，去除斑马鱼的过量药物，用1μg/ml吖啶橙染色。在28.5℃黑暗环境下处理0.5小时，用PBS溶液冲洗两次后用荧光显微镜观察斑马鱼。

 

形态学/功能器官毒性可逆性评价：为了确定马钱子引起的急性毒性是否可逆，在处理24小时后，通过洗涤除去马钱子，并将斑马鱼在新鲜的鱼水中孵育48小时。最后，重新评估器官毒性。

 

结果：LC10和LC50测定：受精后2天和4天的斑马鱼，用不同浓度的马钱子浓度从0.01μg/ml到400μg/ml处理24小时，用20条斑马鱼每浓度进行三次实验。在初步实验结果的基础上，在10μg/ml浓度下无致死性，400μg/ml可使所有2-DPF斑马鱼死亡，100μg/ml条件下死亡较少见。分别评估了额外的浓度，包括50, 100, 150、200, 250, 300、350和400μg/ml。4～DPF斑马鱼，浓度为100μg/ml时，有100%的致死率，在浓度为5μg/ml时无致死性。最后，测定了六种实验浓度的LC10和LC50，分别测定了5, 10, 50、100, 150和200μg/ml对2-DPF斑马鱼的心脏毒性和中枢神经系统毒性。分别测定了5, 10, 25，50, 75，和100μg/ml对4-DPF斑马鱼的肝脏和肾脏毒性。基于斑马鱼急性毒性试验的致死曲线，计算了马钱子对2-DPF或4-DPF斑马鱼的LC10，结果分别为22.2μg/ml和7.2μg/ml。为评价器官毒性，选择心脏和中枢神经系统的五种浓度分别为1, 5, 10、15, 20μg/ml，肝、肾分别为1, 2, 3、4, 5μg/ml。

 

给药24小时后的器官毒性：马钱子对2-DPF或4-DPF阶段斑马鱼给药24 h后的器官形态和功能进行了评价。未经处理的斑马鱼同时进行评估。在给药后4h和给药后8 h记录对心率毒性效应的结果，并进行统计学意义分析。对4小时和8小时给药后的所有数据进行配对分析，比较综合评价值，马钱子给药前和50μg/ml给药后对斑马鱼胚胎心率有显著影响。结果表明，马钱子给药后的心率明显降低，呈剂量依赖性。在五个浓度小于等于LC10的马钱子给药组与对照组的心率无显著性差异。结果表明马钱子对心脏、中枢神经系统、肝脏和肾脏四个器官均有毒性作用。除心率减慢外，还观察到心包水肿。在大脑中观察到组织变色，表明有退化。观察肝脏变色和残留卵黄。躯干水肿表明在高浓度下肾功能可能有缺陷，但在小于等于LC10浓度下没有观察到。

 

给药24小时后评估细胞死亡：受精后2天和4天的斑马鱼用马钱子给药24小时后，评估心脏、中枢神经系统、肝脏和肾脏的细胞死亡。通过荧光吖啶橙染色，对各器官中诱导的细胞死亡进行了视觉评估，并显示出了结果。暴露于马钱子后，在心脏和中枢神经系统以及肝和肾中观察到细胞死亡。与对照组相比，只有少数凋亡细胞存在，给药组心、肾、肾、肝细胞凋亡细胞数呈浓度依赖性增加。

 

马钱子去除48 h后毒性的可逆性评价：五组小于等于LC10给药组心率虽与对照组比较无显著性差异，但心包水肿明显改善。此外，50和25μg/ml的浓度组存活动物的心率也显著提高。肝脏变色，保留卵黄，躯干水肿明显改善。细胞死亡分析显示肝、肾细胞死亡。马钱子诱导的心脏毒性是可逆的。

 

结论：斑马鱼模型已成为评估和预测中药毒性的一个有价值的工具。