摘要：H7N9低致病性禽流感病毒在中国的爆发已引起人们对H7流感病毒感染的关注。我们已经证明，H1N1和H5N1流感病毒在食蟹猴中的致病性与人类几乎相同。我们通过鼻内和结膜接种，比较了食蟹猴H7禽流感病毒的致病性，模拟了人类的自然感染。H7N9病毒和H7N7高致病性禽流感病毒在食蟹猴中表现出更有效的复制和更高的致病性。我们在食蟹猴中获得的结果有助于估计H7禽流感病毒在人类中的致病性。

 

 

简介：H7禽流感病毒（AIVS）在小鼠和雪貂中表现出不同程度的致病性和传递性，揭示比较各病毒株与宿主动物致病性差异的比较研究的必要性。由于非人灵长类动物（NHPS）在免疫学和生理学方面与其他动物模型相似，NHP模型被用于研究各种病原体的致病性、疫苗和抗病毒药物的疗效。在最近使用NHPS的研究中，病毒通过多种途径接种，包括鼻内、口腔、气管内和结膜接种途径，这些途径能最大化感染引起疾病。然而，有必要确定模拟流感病毒自然感染的最佳接种途径，并检查NHPs感染途径之间的症状差异。经鼻和结膜途径有无气管内接种H7N7 HPAIV，引起食蟹猴发热、厌食和体重下降等显著症状。另外，气管内接种病毒并不一定比没有气管内接种引起更严重的症状。我们检测了从人身上分离的H7N9病毒的致病性，其中H7N1病毒和H7N3 HPAIV在食蟹猴中被接种到鼻腔和结膜中，H7N9病毒接种食蟹猴的鼻腔、口腔和气管。

 

动物：5到10岁的雌性食蟹猴。所有手术均在氯胺酮（5 mg/kg）和甲苯噻嗪（1 mg/kg）麻醉下进行，并尽一切努力减少痛苦。在麻醉恢复后一天，动物喂食CMK-2食物颗粒，并随意饮水。1-3号食蟹猴感染AH／1，4-6号感染IT/4580,7-9号感染PK/447，10-12号感染NL / 2586。实验前通过ELISA方法确认动物血清中无流感抗体。病毒接种前两周，麻醉状态下遥测探头植入每个食蟹猴监测体温。AH/1从人类患者体内分离。

 

炎性细胞因子的测定：测定血浆和鼻腔拭子液中炎性细胞因子和白细胞介素-1β、白介素-6、白介素-8、白细胞介素-8、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α和MCP-1的水平。IFN-α的检测限为6.25 pg/ml，其他细胞因子的检测限为2.4 pg/ml。将H7病毒（1×104 TCID50/WELL）接种于汇合MDCK细胞I型胶原涂层的96孔微孔板中，在35℃下培养细胞过夜，洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞。5% Triton X-100的PBS处理后，用1% BSA＋0.5%吐温20＋2.5 mM EDTA 的PBS溶液封闭，添加连续稀释的血浆样品在4°C孵育过夜。加入辣根过氧化物酶（HRP）-共轭抗猴IgG抗体（1:10000×50μL）后，在室温下孵育2 h。洗涤后，用3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺底物（75μL）评价HRP活性。加入1M氯化氢（75μL）终止反应。在450 nm测定光密度（OD）。

 

结果：从接种H7AIVS的食蟹猴拭子收集病毒：为了比较食蟹猴H7 AIVs的致病性，我们通过鼻内和结膜途径接种H7N9、H7N1和H7N3。在感染后第1, 3, 5、7和8天从H7N7感染的食蟹猴鼻腔、气管和支气管拭子样本中测定病毒滴度，另外检查其他样品中的病毒滴度，与使用其他H7病毒获得的结果进行比较。AH／1在鼻、气管和支气管拭子中从第1天到第7天传播。

 

食蟹猴感染H7 AIVs后的症状：我们检测了感染H7禽流感病毒的食蟹猴体内温度的变化。感染AH／1或NL/ 2586的食蟹猴体温较感染前升高，直至第8天。而感染IT/4580或PK／447的食蟹猴表现出与感染前几乎相同的体温，直到第8天P.I. 感染AH／1或NL/ 2586的食蟹猴体温显著高于感染者/PK／4580或PK／447。接种IT/ 4580和PK / 447食蟹猴，身体之间的温度变化没有显着差异。观察到感染H7 AIVS食蟹猴的食欲变化，感染AH／1的食蟹猴与IT/4580或PK／447感染的食蟹猴相比，有显著的食欲下降，而感染NL／2586的食蟹猴的食欲下降与AH／1感染的食蟹猴相似，但第6天除外。观察了食蟹猴在H7 AIVS感染后的体重变化，虽然各组间无显著差异，病毒感染后平均体重下降。感染AH/1、IT/4580、PK/447和NL/2586七天后体重分别为感染前体重的94.6%、96.9%、97.3%和90.3%。结果表明，AH／1和NL／2586在食蟹猴中的发病率比IT/ 4580和PK／447更严重。

 

食蟹猴感染后的抗体应答：第14天从两个接种IT / 4580的食蟹猴采集血样显示同源病毒感染与MDCK细胞反应的IgG轻微增加。在接种PK / 447食蟹猴检测IgG抗体，与MDCK细胞反应的IgG无增加。检测AH／1或NL/2586感染食蟹猴血液标本中同源病毒特异性IgG。AH／1和NL/ 2586诱导获得性免疫应答，包括感染后抗体应答；而IT/4580和PK / 447不足以诱导获得性免疫应答。

 

接种H7 AIVs食蟹猴的细胞因子和趋化因子反应：为检查H7禽流感病毒引起的急性期炎症反应，我们测量了第0, 1, 3、5和7天的血浆和鼻腔拭子样本中炎性细胞因子和趋化因子的水平，因为全身症状可能反映外周血中的细胞因子水平。仅第一天在所有受感染的食蟹猴血浆中检测到白细胞介素-6（IL-6）。食蟹猴血浆中白细胞介素-1β（IL-1β）、巨噬细胞炎性蛋白α（MIP-1α）、巨噬细胞炎性蛋白β（MIP-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均未检测到。感染AH／1的食蟹猴血浆中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的平均水平显著高于接种IT/4580和NL/2586的食蟹猴；IL-6、IL-8和IFN-α的表达差异无统计学意义。AH／1接种食蟹猴的第1, 3天和第5天的鼻拭子中MCP-1的平均水平显著高于接种其他病毒的食蟹猴鼻拭子中的MCP-1。接种AH／1组第1, 3和/或5天时，鼻拭子中IL-6、IL-8、IFN-α、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α的平均水平较感染前升高。这些结果表明，血浆和鼻腔样品中炎性细胞因子和趋化因子的水平与病毒繁殖相关，AH／1在食蟹猴中传播效率更高，诱导的细胞因子反应比从家禽分离的H7N1和H7N3病毒强。