摘要：用来自肺表面活性物质成分的新型黏膜佐剂SF-10对12只雄性食蟹猴经鼻滴入流感疫苗后的全身和粘膜免疫和记忆功能的研究。流感病毒A/加利福尼亚／7/2009（H1N1）PDM血凝素疫苗（HAV）在含15μg或不含SF-10和佐剂单独作用下，每2周滴入鼻腔三次。相比于单独的HAV抗原及SF-10，含SF-10佐剂HAV（SF-10-HAV）引起血清明显的HAV特异性IgG和血凝抑制（HI）滴度，鼻洗液中出现HAV特异性分泌型IgA和中和活性。血清HI抗体效价和中和活性达到峰值水平在鼻腔冲洗的初始接种后6周，然后逐渐下降，在10周和36周恢复至基线水平。SF -10-HAV在36周经鼻内再次快速接种，显著提高了血清和鼻腔的免疫力。一次或两次剂量的再接种在灌洗后2或4周达到几乎最大的免疫力。接种SF-10-HAV，HAV或SF-10以及在实验期间，未观察到显著的不利影响（例如，体重减轻，体温升高，鼻分泌物、外周血白细胞及血小板计数变化）。结果表明，临床应用SF-10于鼻腔流感疫苗的潜力。

 

 

简介：通过对幼龄食蟹猴进行鼻内给予SF-10-HAV，评价合成SF-10佐剂对全身和局部免疫的影响，以及再接种对其记忆的效果；猴模型具有灵长类动物模型的优点，它允许在很长一段时间内连续血清和鼻腔采样，并进行再接种。

 

动物：12只雄性食蟹猴，30-32月龄，体重2.1-2.8kg。用酶联免疫吸附试验测定每只猴子血清和鼻腔冲洗液确认为流感血清阴性。肌肉注射10 mg/kg氯胺酮和80μg/kg甲苯噻嗪对动物进行麻醉，测量体重直肠温度。在接种前的第2天，对所有猴子的鼻腔冲洗液和血清再次检测HAV抗体。

 

抗原、SSF和SF-10-HAV的制备：IAV/加利福尼亚／7/2009（H1N1）PDM乙醚裂解抗原（15μg HA，相当于30.8μg病毒蛋白）被用作HAV抗原。冻干法制备了SSF-HAV复合物。冻干的SSF HAV通过温和混合溶解在生理盐水中，在盐水中加入CVP（pH 7 - 7.5），最终浓度为0.5%以增加粘度。SSF佐剂和CVP增稠剂的混合物改名为SF-10。SF-10-HAV的最终用于鼻免疫接种。

 

接种：鼻内接种疫苗，滴鼻免疫50μL的准备SF-10-HAV到麻醉动物发每个鼻孔，每两周内进行免疫三次，每次动物在含或不含SF-10情况下，接种15ugHAV。所有的动物都表现出明显的全身和粘膜免疫诱导。在第一次接种SF-10-HAV后36周和38周，对动物进行一或两个剂量的SF-10-HAV再接种。

 

样品收集：从每个动物收集血清和鼻腔物来评估抗体反应。为了收集麻醉动物的鼻腔冲洗液，将0.25毫升无菌生理盐水注入鼻孔，然后轻轻移动头部。通过硅胶管收集。对硅管内用1毫升生理盐水冲洗，收集。将鼻腔分泌物立即置于冰上， 500G离心5分钟，上清液贮于-30°C，直至使用。股静脉采血，离心收集血清。为了监测疫苗接种的不良影响，还采集血液样品，在接种前第3天和接种后第1, 15天和第29天进行血液计数分析。

 

酶联免疫吸附试验：通过ELISA方法检测血清和鼻腔洗液中的抗体。血凝抑制试验：使用RDE（II）"SEIKEN"在37度时对血清样品过夜处理来消除非特异性HI因素，简单地，在96孔板的每个孔中加入疫苗抗原的4个HA单位和1%的洗涤的鸡红细胞，然后稀释试验血清，然后在室温下孵育30分钟。HI终点滴度被确定为最高血清稀释度的倒数，产生血凝活性完全抑制。

 

鼻腔分泌物的中和活性：为了测量鼻腔分泌物的中和活性，将200个H1N1PDM的噬斑形成单位（PFU）与100μL连续稀释的鼻腔冲洗液在冰上孵育2小时，然后，通过对马丹-达比犬肾细胞的斑块测定来测量混合物中的病毒滴度。

 

结果：血清和鼻腔冲洗液HAV特异性抗体反应动力学：通过食蟹猴评价SF-10黏膜佐剂作用，我们分析了鼻内滴入SF-10-HAV后在鼻冲洗液抗HAV S -IgA和血清IgG诱导的时间过程。在第二次接种SF-10-HAV后4周观察到抗HAV S -IgA滴度的显著诱导，在第三次接种后6周检测到指数的进一步增加。鼻腔滴注HAV或SF-10后，鼻腔冲洗液中抗HAV-S IgA滴度无明显诱导。表二显示血清抗-HAV IgG滴度的连续变化。在第二次接种SF-10-HAV后4周观察到抗HAV IgG滴度的显著和指数诱导，诱导滴度接近最大值。在一些动物中发现滴度的延迟增加，在第三次接种后第6周达到高峰水平。第二次接种后滴度接近最大的动物在第三次接种后滴度没有进一步增加，接种后4～6周的诱导谱呈现出高原。单独接种HAV或SF-10疫苗后，血清中抗HAV IgG滴度无明显诱导。

 

血清HI滴度和鼻腔洗液中和活性的诱导：我们分析了血清HI滴度的系列变化和鼻腔冲洗中的中和活性。在第二次接种后4周内，用SF-10-HAV鼻腔接种的动物的平均HI滴度增加到40以上。在第三次接种后的6周内，一些动物的HI滴度进一步增加到两倍。相比之下，仅用HAV或SF-10鼻腔接种的年轻动物的HI滴度小于等于20。粘膜S- IgA主要参与粘膜表面的保护。经SF-10-HAV鼻内接种的动物鼻腔冲洗液中和病原体感染的滴度在第二次接种后4周开始增加，在第三次接种后6周进一步增加。与HI滴度的变化相似，在6周的实验期内，鼻腔内用HAV或SF-10单独免疫鼻腔的动物中没有检测到中和活性。

 

三个疫苗接种组（SF-10-HAV，HAV和SF-10）的所有动物的直肠温度在每天上午10:00进行测量。接种后3～6天，食蟹猴常温温度范围为39±0.5°C，各组间差异无统计学意义。食物消耗（估计）记录每天一次，所有动物实验期间没有检测到剩余物。三个疫苗接种组体重无明显变化。在接种后两周，对三种接种疫苗组进行鼻红斑、红肿、鼻分泌物、打喷嚏等皮肤反应的临床检查，未发现明显病变。在接种疫苗前3天和接种疫苗后第1, 15天和第29天，用SF-10-HAV、HAV或SF-10接种的所有动物，血液血液学分析白细胞、血小板、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞的数量。这些参数没有观察到统计学上的显著变化，尽管接种后第1天的嗜碱性粒细胞水平在三组中都有短暂增加的趋势。

 

SF-10-HAV的再接种效果：HAV特异性S- IgA效价和中和活性，HAV特异性- IgG效价和HI滴度，接种三次后达到峰值水平。在接种后6周观察到的鼻腔免疫的峰值，并在36周内逐渐恢复到初始水平。6周时血清免疫也恢复。为了评估鼻内接种SF-10-HAV对免疫记忆的长期影响，我们研究了使用鼻腔冲洗和血清进行再接种的效果。在这些实验中，接种SF-10-HAV的猴子36周和38周恢复到基线后再次接种疫苗。用SF-10-HAV在36周和38周进行一次和两次的再接种后，鼻腔冲洗液中的抗HAV S -IgA滴度和血清中和IgG滴度在诱导中和中和HI滴度的同时比幼稚动物更迅速。两次再接种后的诱导免疫高于首次动物三次接种疫苗诱导的免疫。一次剂量再接种诱导的效果几乎相当于初孵动物两次接种的效果。

 

结论：粘膜佐剂SF-10是由人肺表面活性物质衍生的合成佐剂，具有安全的粘膜佐剂作用，并引起足够的血清和粘膜抗体反应，幼龄食蟹猴提供了显著的局部和全身免疫。SF 10-HAV在血清和鼻腔冲洗液中抗体效价下降至基线水平后的再接种，与幼龄未接种猴相比，能迅速和更有效地诱导免疫力。结果提示SF-10佐剂用于鼻内接种HAV具有潜在的临床应用价值。