摘要：约100K神经元组成简单透明的脊椎动物斑马鱼幼虫脑，非常适合于解释整个神经电路活动的潜在行为。它们体积小（长4～5毫米）与96孔板兼容，使幼虫斑马鱼适合于高通量的筛选。尽管有这些吸引人的特征，但是斑马鱼幼虫的行为特征与其他的模式生物以及成年斑马鱼相比很缺乏。

 

结果：在这项研究中，我们已经将幼虫斑马鱼的生理和行为反应表征为几种容易适应的刺激，包括热、冷、紫外线、机械干扰（MD）和社会隔离（SI）。这些刺激是基于斑马鱼幼虫对其的厌恶性来选择的。使用一个光明/黑暗的选择范式，其中斑马鱼幼虫显示天生的暗回避行为（即，恐惧症），我们发现，热，冷和紫外线刺激显着提高他们的黑暗回避，热具有最显著的效果，而MD和SI对行为的影响不大。使用皮质醇测定，发现所有的刺激，除热和SI外能显著增加全身皮质醇水平。

 

结论：这些结果确定了一系列可以容易地给予斑马鱼幼虫的应激源。那些引起行为和生理水平差异反应的刺激在电路水平上需要进一步研究以了解潜在机制。抗焦虑剂减轻暗回避，斑马鱼幼虫的光/暗偏好行为同恐惧/焦虑相关。

 

 

背景：斑马鱼幼虫期从受精后5天开始，一直持续到数周龄。体积很小，可大量使用，从而使它们适合于高通量的筛选。此外，它们具有典型的脊椎动物解剖学和由100 K神经元组成的简单透明的脑。这一特性使它们在细胞分辨率上完全适合于全脑神经活动成像，这一技术将极大地促进对功能神经回路的理解。从5 DPF开始，斑马鱼幼虫自由生活，寻找食物和逃避捕食者，暗示简单而功能性的处理奖赏和厌恶的神经回路已经形成。. 然而，与成年斑马鱼和其他模型系统相比，我们对斑马鱼幼虫的行为知之甚少。目前尚不清楚幼虫斑马鱼在行为和生理水平上可能对各种应激源的反应。在这项研究中，我们选择了五个容易驯服的感知厌恶性刺激，并在行为和生理层面上表征了它们对斑马鱼幼虫的影响。这些刺激包括热、冷、紫外线、机械干扰（MD）和社会隔离（SI）。在一个有机体的优选温度范围之外，过多的冷热被认为是有压力的。紫外线是潜在的应激源，因为它增加了胚胎和成熟斑马鱼的氧化应激。MD以抑制或追逐的形式和SI在成年斑马鱼中表现出应激反应。施用这些刺激后，用光/暗选择试验评估斑马鱼幼虫的行为反应，并用皮质醇法测定它们的生理反应。我们的研究结果揭示了一个有趣的现象，不同的压力源可能优先引起行为或生理反应。我们的数据还加强了光/暗选择测定对测量斑马鱼幼虫焦虑相关的行为是敏感的。

 

方法：动物：AB野生型鱼杂交，不受干扰。第二天的早晨收集胚胎（年龄设定为受精后第0天, 0 DPF）。分别放入不同的平皿中，每个平皿不超过40个胚胎。这些胚胎从第0天到第2天分别在28°C下生长。在3 DPF，胚胎暴露于正常的昼夜节律。白天的光照强度为350勒克斯。在测试前一天（5 DPF），将4只幼虫从100毫米培养皿中轻轻移走，并转移到35毫升培养皿中，加入7毫升28°C培养液。每组6个35mm的平皿，每皿盛有24只幼虫。每组2个用于行为试验，其余4个用于皮质醇测定。所有的行为测试和皮质醇测定在6 DPF进行。

 

急性应激源：幼虫被带到行为室，并允许习惯环境10分钟。习惯化后，幼虫用各种急性应激剂处理5分钟。

 

对照：对照组不应用应激源。在各皿中加入17毫升28°C培养液。

 

热刺激：将10毫升50°C培养液加入7毫升28°C培养液中，用移液吸管形成17毫升33°C的仔鱼环境。处理时间为5 min，监测水温，5 min内温度从33°C逐渐下降，5 min达到30°C。

 

冷刺激：将10毫升4°C培液液加入含7毫升28°C培养液的皿中，用移液吸管形成17毫升18℃的仔鱼环境。处理时间为5 min，在5分钟内，温度从18℃上升到23°C。

 

紫外（UV）刺激：6个盘子放在白板上置于紫外光下。然后用紫外线（365 nm，1.9-2毫瓦）处理幼虫5分钟。处理前，将10毫升28°C培养液加入移液吸管中，每盘17毫升28℃培养液。

 

机械干扰（MD）：将10毫升28°C培养液加入移液吸管中，在各皿中保持17毫升28°C培养液。在每皿中放入一个小搅拌棒，进行搅拌。

 

社会隔离（SI）：将一个平皿中的四个幼虫分别分到4个不同 的个体培养皿中，每皿含有17ml培养液。将每皿的周围用蓝色不透明胶带缠绕，确保单个幼虫不会对其他同类有任何视觉接触。处理持续时间5min。

 

行为测试：一个灯箱放在一个桌子上，白炽灯泡放在灯箱的两侧，用漫射光照亮隔间。黑白条纹，5厘米宽，由红外透射丙烯酸制成，然后贴在灯箱的顶部。光侧的光强度为2000 LX，暗边为50 LX。每个轻/暗试验装置由四个单独的方形罐（L4cm×W4cm×H1.5cm）组成。每个罐被分成两个大小相等的隔间，一个是白色的，一个是黑色的。隔墙的四周分别用不透明的白色和黑色胶带包围，以消除墙壁的透明度。我们发现在隔间壁附近的幼虫很难追踪，因此添加了丙烯酸插入物作为间隔物。插入物由红外透射丙烯酸制成，因此在我们的视频中是看不见的。所有丙烯酸类成分采用CalelDRAW设计，并用激光切割机制造。每个槽内装满10毫升28°C培养液（深：5毫米）。在每一轮记录之间，更换水箱中的水。

 

光/暗选择试验：在光/暗选择试验中，以前发现斑马鱼幼虫更喜欢光（或避暗），这种行为被认为是焦虑相关的。因此，在斑马鱼幼虫中光照时间增加的百分比被认为反映了焦虑的增加。5分钟应激处理后，仔鱼从托盘转移到每个容器的中心。

 

药物治疗：幼虫如上文所述。在行为分析日（6 DPF），将幼虫放入不含药物（对照）、100μM利眠宁或75μM丁螺环酮的培养液中1小时。药物浓度和时间长度是通过试点实验确定，其中幼虫以不同浓度处理，并根据存活和运动活动监测效果。

 

视频跟踪与数据分析：在行为测试期间，同时记录两个装置（总共8个方罐）。每台设备上设置一台红外摄像机。通过位于水箱上方的摄像机进行8分钟的记录。在8分钟记录结束时，将斑马鱼幼虫收集在盘子中用冰进行安乐死。使用EthoVIEW XT 5追踪斑马鱼幼虫的位置，以分析数字视频文件。输出参数包括光区或暗区的持续时间和游泳速度。对于光/暗选择测定，在8分钟记录期间计算光/暗侧花费的时间百分比和选择指数。高达10至15%的样本被排除在外，由于高度冻结和/或靠近腔室壁的运动而未能追踪幼虫。

 

皮质醇测定：在冰冷PBS中收集四只幼虫，转移到收集管上，放置在干冰上。去除多余的PBS以确保最终体积为50μL，并存储-70°C直到下一步。每管加入150μL冰冷PBS，总体积为200μL。样品用手持式均质器均质30秒至1分钟。20μL的组织匀浆被保存在一个单独的管中，用于估计总蛋白。将180μL的剩余匀浆加入1400μL乙酸乙酯中用于提取。在7000℃下离心管15分钟，将各管中的有机层转移到新鲜管中，并在通风柜中蒸发。最后，使用皮质醇EIA试剂盒测定。BCA蛋白检测试剂盒用于进行蛋白质分析。

 

结果：斑马鱼幼虫表现出对光的先天偏好（或避暗），这种选择与成年斑马鱼相反。抗焦虑化合物可以显著减轻暗回避，暗示行为与焦虑有关。如果行为确实与焦虑有关，人们会认为应激源会对焦虑症的行为产生改变作用。我们选择了五种不同的刺激，根据他们的感知厌恶性质。这些潜在的压力源是热、冷、紫外线、机械干扰（MD）和社会隔离（SI）。幼虫暴露于急性应激5分钟，因为更长的暴露被发现影响运动活动和冻结，影响光/暗选择行为。用光/暗选择试验测定斑马鱼幼虫对这些应激源的行为反应，并用全身皮质醇试验评估它们的生理反应。

 

热、冷和紫外线刺激显著增加了光/暗选择试验中的暗回避行为：根据斑马鱼幼虫的运动轨迹观察热应激、冷应激和紫外光对光区偏好的显著影响，并进行统计学分析。从运动轨迹来看，我们观察到，与对照组相比，仔鱼在热应激、冷应激和紫外光处理后，在游泳池的光区游泳的时间明显增加。结果表明，在热应激、冷应激或紫外线照射下，仔鱼相对于对照组表现出较强的避暗作用。

 

社会隔离和机械干扰不会显著改变光/暗偏好行为：与热应激、冷应激和紫外光处理相比，社会隔离和机械干扰（MD）对选择指数没有显著影响。运动痕迹还表明，在这些刺激处理后，仔鱼对光区没有明显的偏好。这些数据表明，社会隔离和机械干扰不影响光/暗偏好行为。

 

五种应激源对运动行为的影响：暴露于各种应激源时的光/暗偏好行为的变化可能是由于内在情绪状态（例如焦虑相关）或感觉运动能力的改变。我们确定了五个压力源对运动行为的影响，因为运动模式的改变可能会物理地阻碍位置偏好的能力。此外，这种变化（例如冻结的增加）可能提供焦虑样状态。热刺激组和冷刺激组处理后的速度均明显低于对照组，而紫外光、社会隔离和机械干扰均无明显影响。

 

五种应激源对皮质醇水平的影响与其对光/暗选择行为的影响不一致：综上所述，我们的数据表明，热应激、冷应激和紫外光照射可以诱发明显更强的暗回避，但不受社会隔离和机械干扰的影响。接下来，我们测量了相对皮质醇水平（绝对皮质醇浓度/总蛋白浓度），这通常被认为是焦虑的生理指标。冷应激、紫外线和机械干扰对仔稚鱼相对皮质醇水平有显著影响，但热应激和社会隔离对皮质醇水平无显著影响。特别值得注意的是，热应激引起的最强烈的暗回避，它没有显著影响相对皮质醇水平。相比之下，机械扰动导致相对皮质醇水平的最高上升，但没有带来任何光/暗偏好行为变化。冷和紫外线增加暗回避和皮质醇，而社会隔离也不影响。

 

焦虑与幼虫光/暗选择行为的联系：我们进行了实验，以确定两种常用的抗焦虑药是否用于治疗人类焦虑障碍，利眠宁和丁螺环酮，会影响热应激加重的暗回避。用100μM氯氮卓或75μM丁螺环酮预处理幼虫1 h，在无应激条件下显著降低避暗效果。用抗焦虑药预处理的幼虫暴露于热应激，这些热应激幼虫的暗回避也显著减少。因此，这些数据表明，斑马鱼幼虫的光/暗偏好行为确实是焦虑相关的。

 

结论：一系列的压力源，包括热，冷，紫外线，和机械干扰，可以很容易地增加暗回避行为和/或全身皮质醇水平。这一发现，连同焦虑消除黑暗回避的概念进一步加强了斑马鱼幼虫的光/暗偏好行为是恐惧/焦虑相关的。