【摘要】目的　观察维生素B6(VB6) 缺乏对生长期大鼠学习记忆功能的影响, 并从脑发育、神经递质方面探讨有关机制。方法　用避暗法检测大鼠学习记忆行为, 用荧光法测定脑组织核酸和单胺类神经递质含量。结果　VB6 缺乏组大鼠学习记忆能力明显下降, 同时脑中多巴胺和52羟色胺显著降低, 而脑发育有关指标未见异常改变。结论　VB6 可通过调节脑中单胺类神经递质水平, 影响大鼠学习记忆能力。

    【关键词】　 维生素B6　学习记忆　脑发育　神经递质　　维生素B6

    (V B6) 主要以辅酶形式参与体内多种物质和能量代谢。国外研究发现母体缺乏V B6会导致子代许多酶系统的功能障碍, 如谷氨酸脱羧酶(GAD)和转氨基酶(GOT, GPT)的活性改变, 这些酶对于神经递质合成、髓鞘形成和氨基酸代谢极为重要。新生动物缺乏VB6可导致震颤、易怒、运动失常等行为异常。近年研究发现大鼠缺乏VB6, 脑中GAD活性降低, 同时诱发癫痫发作, 人体实验也发现VB6 缺乏者脑电图异常, 并伴有情绪等心理变化, 由此推测VB6 对维持脑功能正常发挥有重要作用。学习记忆是脑的高级机能之一, 有关VB6 对学习记忆的影响还没有系统的研究。本实验用缺乏VB6饲料喂饲生长期大鼠, 观察了大鼠学习记忆行为的改变, 并从脑发育和神经递质方面探讨了有关机制, 为今后从营养角度确保学习记忆功能的正常发挥奠定理论基础。

    材料与方法

   一、实验动物分组与饲养

    70g左右Wistar大鼠(本所动物房提供)30只,按体重随机分为3组, 每组雌雄各半, 用不锈钢笼分笼饲养, 自由饮水。缺乏组, 喂缺乏VB6 饲料; 对照组, 喂正常含VB6(7mg/kg)饲料; 对喂组, 喂对照组饲料, 与缺乏组对喂(每日摄食量与缺乏组相同), 饲料参照AIN-93 合成饲料配方配制。喂养28天后进行行为实验, 一周后断头处死大鼠, 低温下分离脑组织。

    二、观察指标及测定方法

    1. 红细胞天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性系数: 酶偶联法

    2. 被动回避反应实验: 避暗法利用大鼠喜暗的习性设计而成。实验装置分明暗两室, 大小均为20×30×40cm, 室间有一拱形小门相通。明室上方装有一盏15W钨丝灯, 两室底部均铺有不锈钢栅。暗室底部通以40V电压。实验时先将大鼠面部背向洞口放入明室, 同时启动计时器,记录其进入暗室时间, 为潜伏期。当大鼠穿过洞口进入暗室后立即通电, 直至大鼠遭电击逃回明室, 记录大鼠遭电击至逃出暗室的时间。第一天为学习过程,一周后进行记忆测试, 观察并记录5min内大鼠由明室进入暗室的时间和错误率(错误反应动物数/每组动物数)。

   3. 脑组织蛋白质含量: 考马斯亮兰法

    4. 脑 组 织 核 酸 含 量: 荧 光 探 针 菲 啶 嗅 红(Ethidium Bromide)法

    5. 脑组织单胺类神经递质含量: 荧光分光光度法

    三、统计学处理

    行为实验用中位数M表示, 组间比较用秩和检验; 其它指标均用x±s表示, 组间比较用t 检验。

    结　　果

    一、大鼠红细胞AST活性系数红细胞AST活性系数与机体维生素B6 水平有关, 超过1. 8 即可认为VB6 缺乏。本实验中缺乏组红细胞AST活性系数平均达2101(2101±0139),明 显高于其它两组(对喂组1120±0125,对照组1141±0130), 表明机体已处于VB6 缺乏状态。

    二、大鼠学习记忆能力

    大鼠避暗实验结果显示: 在训练阶段缺乏组大鼠的潜伏期( 在亮处停留时间)略高于其它2组, 表明其对光刺激敏感性低, 而进入暗处遭遇电击时间明显高于其它2组, 表明其应变反应能力较差, 获得记忆时间长。一周后记忆再现测定发现, 对照组大鼠均在亮处停留满5min, 而缺乏组大鼠有60%出现错误, 其错误率明显高于其它两组, 三、大鼠脑发育状况脑重3组基本相同, 海马重量缺乏组略低于其它两组; 脑中核酸和蛋白质含量各组没有明显差别,四、大鼠脑组织单胺类神经递质含量大鼠脑中去甲肾上腺素水平3组无明显差别,但多巴胺、52羟色胺(52HT)含量缺乏组明显低。

    讨　　论

    本实验利用饲料中VB6 不足造成实验大鼠机体VB6 缺乏。通过避暗实验检验大鼠学习记忆能力, 结果显示,VB6缺乏可显著降低实验大鼠被动回避实验中的潜伏期和躲避电击的成功率, 表明VB6缺乏可影响大鼠的应变反应能力, 提示VB6对大鼠的学习记忆有重要作用。学习记忆是一个复杂过程,脑的正常发育和结构完整是脑功能正常发挥的必要条件; 神经递质的合成与释放是学习记忆的生理基础之一。但是VB6能否通过影响脑发育、介导神经递质合成来参与调节学习记忆还未得到证实。有关 B6 缺乏影响脑发育近年已有报道。Kirksey等给妊娠母鼠饲以不含VB6的饲料, 对出生第15天的子代进行脑组织形态学观察, 发现多个脑区结构异常: 新皮层和小脑神经元数目减少,小脑Purkinje氏细胞和新皮层锥体细胞和星状细胞的树突分枝减少; 纹状体和大脑皮层的突触密度减少, 并出现大量的固缩神经元, 以此推测神经元寿命缩短。与其结构相对应, 脑的蛋白质、核酸和脂类合成和代谢均出现异常。Geng等在用妊娠18天的胎鼠脑组织进行体外神经细胞培养, 发现VB6 对海马、皮层神经元的生长均有促进作用。这些研究均表明V B6是妊娠和哺乳阶段脑发育必不可少的营养素。但有关VB6 对断乳后大鼠脑发育的影响报道还很少。我们观察断乳后生长发育期VB6 缺乏大鼠的脑发育状况, 发现VB6 缺乏大鼠脑和海马重量以及脑中蛋白质和核酸含量与对照组相比均无显著差别, 表明VB6 缺乏未造成大鼠脑发育的明显异常。其原因可能是机体各器官、组织生长发育并不同步,相对其它器官而言, 脑的生长发育速度快, 过程短。妊娠和哺乳阶段是脑发育的旺盛期, 而断乳后脑发育基本结束, 因此对VB6缺乏不敏感, 这提示VB6缺乏不大可能通过影响脑发育干扰蛋白质和核酸的生物合成, 进而引起学习记忆障碍。单胺类递质系统参与学习记忆过程。损害多巴胺能系统将会造成学习记忆功能的损伤, 如帕金森氏症就是与纹状体的多巴胺能系统的损伤有关。52HT也可调节情绪、记忆, 它本身属于抑制性神经递质, 起到安定中枢作用。给动物服用52HT受体拮抗剂可出现明显的精神错乱现象。本实验结果V B6缺乏的大鼠脑中DA、52HT含量均显著降低。VB6 可影响DA和52HT的合成代谢与其作为氨基酸脱羧酶的辅酶有关。Gularte等研究发现出生前后VB6不足使处于发育阶段的脑纹状体区多巴胺脱羧酶活性降低。脑中52HT是色氨酸的代谢产物, 52羟色氨酸脱羧酶是其关键酶。有实验发现单纯在饲料中添加色氨酸脑中52HT没有明显变化, 只有同时补充VB6 脑中52HT方可增加, 提示V B6 是色氨酸代谢合成52HT的辅因子。总之, 本实验结果显示VB6缺乏可造成大鼠学习记忆障碍, 而脑组织单胺类神经递质的合成代谢异常有可能是其原因之一。