摘要：Nrf2是驱动多器官系统中抗氧化基因表达的转录因子。我们假设Nrf2过表达可以治疗应用于氧化还原稳态被破坏的疾病。在本研究中，腺相关病毒(AAV)-Nrf2在小鼠急性对乙酰氨基酚诱导的肝毒性模型中进行了试验，并成功地给予了肝毒性的保护，验证了载体设计和NRF2介导的早期保护作用。此外，AAV-Nrf2在光诱导小鼠年龄相关性黄斑变性模型的治疗潜力也被测试。成年BALB/c小鼠用AAV-NFR2玻璃体内注射，并在注射后受到轻度损伤。分别用光学相干断层摄影和电子视网膜摄影监测光损伤后的视网膜厚度和功能。损伤后3个月，注射眼与未注射的对照组相比视网膜厚度更大。在损伤后1个月，AAV-NFR2注射促进了光损伤的完全功能恢复。结果显示Nrf2过度表达在多器官中的治疗潜力。

 

 

简介：Nrf2是一种转录因子，在急性和慢性环境应激反应中起着无处不在的作用。内源性抗氧化基因表达受抗氧化反应元件（ARE）启动子区的调控，Nrf2结合ARE，作为主调节器驱动下游抗氧化剂基因表达。NRF2在氧化还原稳态条件下持续降解，仅在氧化应激条件下才具有转录活性。Nrf2在疾病病理生理学中的作用已经在多器官系统中得到了探索，包括肝脏、肺、心脏和大脑，NRF2-ARE通路的激活已被证明在各种氧化应激系统中具有保护作用。大多数老化和退行性疾病至少部分是由于暴露于氧化应激。例如，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）在许多慢性眼病的发病机制中起着重要作用，特别是老年性黄斑变性（AMD），在美国，AMD是导致失明的主要原因。值得注意的是，与目前使用的许多其他免疫学或遗传动物模型相比，光诱导的视网膜变性更接近于AMD的许多特征。氧化应激是视网膜变性的治疗靶点.长期以来，抗氧化维生素和补充剂一直被证明在AMD中提供治疗益处，鉴于许多视网膜疾病的遗传异质性和多因素病因学，我们假设NRF2的过表达可能是一种普遍适用的治疗策略，以治疗各种疾病的氧化应激。

 

结果：AAV-NFR2载体体外高效驱动ARE和减少活性氧：将人Nrf2克隆到含有普遍存在的CBH启动子的AAV表达质粒中。免疫印迹证实HEK29 3T细胞转导Nrf2过表达和ARE驱动基因表达。伴随Nrf2过表达，ARE驱动基因γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ- GCSm）上调。血红素氧合酶-1(HO-1)在Nrf2过表达后同样上调，作为转染控制，α1-抗反转录酶是并行转染的。进一步评价AAV-NFR2在氧化应激后抑制活性氧水平的能力。HEK293T细胞经AAV-Nrf2转染或未转染，经过氧化氢和三氧化二砷诱导氧化应激。AAV介导的Nrf2过表达导致H2O2-和三氧化二砷诱导的ROS水平相对于对照组降低，用细胞内氧化应激荧光指示剂CM-H2DCFDA进行测定。在无病毒与AAV荧光素酶对照之间没有观察到荧光差异。

 

AAV-NFR2保护小鼠免受对乙酰氨基酚肝毒性的影响：Nrf2在保护肝脏免受急性对乙酰氨基酚引起的损伤中的作用已被描述过。通过尾静脉注射普遍存在的CBA启动子，发现AAV8血清型在肝脏中高效表达。在CBA启动子控制下，Nrf2被克隆到AAV2反向末端重复序列（ITR）主链中，并被包装到AAV8衣壳中。nrf2-／-小鼠在对乙酰氨基酚（APAP）给药前1个月尾静脉注射AAV8-CBA- Nrf2。口服给药600 mg/kg对乙酰氨基酚可使Nrf2-/-小鼠在48小时内死亡86%,而对野生型对照组无明显影响。AAV-Nrf2预处理对Nrf2-/-小鼠有保护作用。APAP给药后24小时肝组织H&E染色石蜡切片显示Nrf2-/-小鼠小叶中心广泛苍白坏死区。在给予APAP之前接受AAV-Nrf2的Nrf2-/-小鼠不存在。除了Nrf2-/-小鼠的基因替代，我们还观察了野生型小鼠中nrf2的过度表达。同样，AAV-NFR2也介导了APAP诱导的肝毒性对野生型小鼠的保护作用。给药1000 mg/kg APAP可导致野生型小鼠80%的死亡率，而在APAP给药前接受AAV-NFR2的野生型小鼠受到保护。APAP后24小时肝组织H&E染色石蜡切片显示野生型小鼠小叶中心坏死，而给予APAP前接受AAV-Nrf2的小鼠则无此现象。

 

玻璃体内注射AAV2视网膜转导：为了探讨Nrf2在慢性疾病中的治疗潜力，将AAV-Nrf2应用于光诱导AMD模型。将GFP和nrf2克隆到TR CBH-AAV表达质粒中，并分别包装成AAV2.5衣壳。AAV2.5先前在R.J.S.实验室中设计成将AAV1的改良转导特性与针对两种亲本血清型的抗体的抗原反应性降低结合起来，同时保持AAV2的受体结合特性。玻璃体内注射AAV-NFR2，注射后8个月Western blot检测表达情况。虽然在视网膜裂解液中未检测到NRF2蛋白，与Nrf2-/-和野生型小鼠未注射眼内的对照裂解物相比，ARE控制的典型NRF2读出物HO-1被强烈上调。为了评价载体的趋向性，将AAV2-CBh-GFP和AAV2.5-CBh-GFP分别以1×108个载体基因组注入小鼠眼内，每只眼注射1μL。注射后4周的荧光眼底镜显示AAV2.5介导的可见荧光比AAV2更大，特别是在视网膜血管中。免疫组化的视网膜横截面显示AAV2.5在Müller胶质细胞中的转导与AAV2相比增加..

 

AAV-NFR2保护视网膜结构免受严重光损伤:为了检测AAV-NFR2在视网膜变性中的治疗潜力，采用光诱导视网膜病变模型。成年BALB/c小鼠一次性注射AAV-NFR2，另一只眼睛不注射。注射六周后，小鼠暴露于4000lux白光下3小时，导致严重视网膜变性。使用体内光学相干断层扫描（OCT）视网膜成像监测视网膜形态学从1周开始，并随访至3个月。OCT扫描在四个主要方向相对于每个眼睛的视神经。为了将OCT上看到的定性病理结果转换成可量化数据用于比较，OCT图像被蒙蔽，并对病理特征进行评分。光损伤后1周和3个月的OCT扫描对病理特征进行评分，包括外丛状层（OPL）、外界膜（OLM）和内段/外段（IS/OS）连接处破裂以及视网膜脱离的存在。病理特征评分为轻微（1分）或大（2分），并且它们被绘制为同一动物注射的和未注射的眼睛的配对视网膜病理评分。在光损伤后1周，AAV-Nrf2似乎没有介导视网膜结构的显著抢救或保护，注射眼和未注射眼的视网膜病理评分在这早期时间点没有显著差异。然而，在光损伤后的几个月，AAV-Nrf2对视网膜深层结构的保护作用变得相当明显。而未注射的眼睛在光损伤后3个月继续退化，注射AAV-Nrf2的视网膜受到部分保护，以免进一步退化，未注射的眼睛显示出明显高于注射AAV-Nrf2的眼睛的视网膜病理评分。来自光损伤眼睛的典型OCT和H&E图像显示严重的感光器损失，表现为大量外核层(ONL)变薄以及感光器内段和外段的缩短。在光损伤后3个月，视网膜的H&E染色还显示，与AAV-Nrf2注射眼暴露于光损伤和注射眼和光损伤天真相比，未注射眼暴露于严重光损伤时视网膜结构高度可变。虽然发生了一些光感受器变性，如ONL变薄，内外节段缩短，注射AAV-Nrf2的眼睛保持了类似于原始视网膜的均匀层状视网膜层。OCT扫描测量总视网膜厚度和ONL厚度。在光损伤后1周，注射组和未注射组的视网膜厚度和ONL厚度无显著差异。注射和未注射的眼睛与未注射的眼睛相比，视网膜总厚度和ONL厚度均显著降低。在光损伤后3个月，注射AAV-Nrf2的眼睛与未注射的眼睛相比，显示出更大的视网膜总厚度和ONL厚度。与单纯视网膜相比，光损伤后视网膜和ONL厚度显著降低，与注射无关。有趣的是，在注射AAV-Nrf2的眼中，ONL和总视网膜厚度在1周到3个月之间没有继续减少，而未注射AAV-Nrf2的眼中，总视网膜厚度在此期间显著降低。

 

AAV-NFR2保护视网膜功能免受严重光损伤：ERG在严重光损伤后不同时间点对视网膜功能进行评价。在光损伤后1周，光应激后a波和b波振幅与单纯视网膜相比显著降低，与注射无关。此外，在注射和未注射的眼睛之间观察到ERG振幅没有显著差异。在平行实验中，在光损伤后3个月检查一组独立的动物，此时，a波和b波振幅与天然的眼睛相比仍然显著降低。然而，AAV-NFR2注入眼的A波和B波振幅显著大于未注入眼的A波和B波振幅。比较视网膜功能随时间的变化，光损伤后3个月的a波振幅与1周时间点相比显著降低，与注射无关。在未注射的眼睛中，B波振幅也在3个月内显著减少。AAV-NFR2注射眼的B波振幅在这段时间内没有明显变化。在所有11种刺激强度下，比较AAV-Nrf2注射眼和未注射眼的结果，发现AAV-Nrf2介导的a波振幅保护仅在高刺激强度下有效，而b波振幅在AAV-Nrf2注射眼和未注射眼之间有显著的保护作用。

 

AAV-NFR2突变体介导光损伤的全功能挽救：注射后4个月，小鼠暴露于4000lux亮白光照射2小时，导致中度视网膜变性。视网膜功能通过ERG进行评估，与幼鼠相比，在中度光损伤后1周，注射眼和未注射眼均发现其严重减少。光损伤后1周内注射和未注射眼ERG振幅无明显差异。然而，在光损伤后1个月，AAV-Nrf2已经恢复了与年龄匹配的光损伤幼稚动物的功能，而未注入光的眼睛的ERG振幅仍然显著降低。此外，与未注射的眼睛相比，注射AAV-NFR2的眼睛的B波振幅显著更大。在检查视网膜功能时，注射AAV-Nrf2后1个月时与光损伤后1周相比，a波振幅显著增加，而未注射的眼睛没有任何改善。在光损伤后1个月，AAV-Nrf2注射眼和未注射眼在所有11个刺激强度上比较，AAV-Nrf2给药眼在光强度范围内b波振幅显著增加。