摘要：我们报告缺乏功能性LDLR（低密度脂蛋白受体）的小鼠，一种人类家族性高胆固醇血症的动物模型，显示出昼夜节律异常。在持续黑暗下的自由奔跑行为实验中，这些小鼠表现出延长的活跃期和明显的双峰节律。即使昼夜节律被光明和黑暗周期所牵制，这些小鼠在黑暗期开始时表现出明显的行为开始强度减弱。此外，我们假设高胆固醇血症和生理节律异常的结合可能影响心血管疾病的进展。为了研究这种可能性，我们通过同时将突变引入核心时钟基因周期2来产生具有受损昼夜节律的LDLR缺陷小鼠，结果发现，随着炎症细胞因子IL-6水平的增加，这些小鼠的动脉斑块面积显著增大。结果表明，昼夜节律功能障碍可能与心血管疾病的发展或进展有关。

 

 

简介：几乎所有生物在生理和行为上都表现出昼夜节律，这些节律是由内部昼夜节律时钟驱动的。中枢昼夜节律由时钟基因驱动的负反馈转录环组成。这种细胞自主转录反馈回路产生广泛的大量基因的昼夜节律表达，这反过来又导致生理过程中的昼夜振荡。昼夜节律时钟使得在一天中的适当时间能最大限度地表达基因，允许生物体适应地球的自转。相位调节的昼夜节律输入包括两个主要途径。第一个是通过下丘脑视交叉上核（SCN）的光输入通路，称为昼夜节律起搏器。SCN通过视网膜下丘脑束直接接收光输入，并将体液和神经元信号发送到外周时钟以进行系统调节。二是进食途径。时间摄食限制改变外周组织的昼夜节律，而不影响SCN中的昼夜节律。因此，昼夜节律时钟以灵活但依赖于相位的方式响应于环境信号，例如光和营养，进行相位调整。慢性昼夜节律紊乱是一系列疾病的重要危险因素，从睡眠障碍到糖尿病和癌症。深入了解生理机能障碍的机制——在现代生活方式中经常发生——对于预防生理机能障碍相关的疾病是至关重要的。近来，饮食习惯的改变使人们持续关注慢性代谢异常对生理节律特性的影响。例如，高脂饮食（HFD）先前已显示抑制外周时钟基因表达节律，导致运动活动幅度显著降低和自由运动时间延长。进一步的研究显示，除了昼夜节律紊乱外，HFD还引起大规模的新生性振荡转录，导致生物过程的广泛重塑。有趣的是，在HFD期间限时喂养可以恢复生物钟的振荡及其靶基因的表达，并改善代谢异常，包括肥胖、高胰岛素血症和肝脂肪变性。我们研究了慢性高胆固醇血症，发达国家常见的代谢异常，对缺乏功能性LDLR（低密度脂蛋白受体）的小鼠的行为昼夜节律的影响。我们进一步假设，高胆固醇血症和生理节律异常的结合可能有助于心血管疾病的发展和进展。通过Per2中产生一个核心时钟基因突变产生LDLR-/-小鼠，对其进行检测。

 

动物：Ldlr-/-(库存号002207)和Per2 m/m(库存号003819)小鼠从Jackson实验室(C57BL/6背景)购买，并与C57BL/6小鼠回交。在所有实验中，WT小鼠是LDLR-/-小鼠，而不是Per2 m/m和LDLR -/-Pr2 m/m小鼠。LDLR-/-、Per2 m/m和LDLR-/-Per2 m/m小鼠均无同胞关系。将纯合Ldlr-/-和Per2 m/m小鼠杂交，再将杂合子杂交，获得Ldlr-/-Per2 m/m小鼠。使用PCR进行基因分型。小鼠自由采食和饮水。MF（3.6千卡/克，61.5%千卡碳水化合物，25.7%千卡蛋白质和12.8%千卡脂肪）作为正常饮食（ND）。高脂肪饮食（HFD；3.9千卡/克，42.7%千卡碳水化合物，20.4%千卡蛋白质和36.9%千卡脂肪）。雄性小鼠在5周龄时断奶，在10-11周龄时暴露于ND或HFD，并饲喂20、24或28周。每2周测量体重。在采血前一晚，动物禁食。心脏穿刺取小鼠血，肝素化管内收集。离心后收集血浆，进行血浆总胆固醇（T-CHO）和甘油三酯（TG）浓度的测定。用葡萄糖计测量血浆葡萄糖浓度。使用Luminex技术测定血浆中IL-6和胰岛素的浓度。

 

行为分析：用ND或HFD喂养10～11周龄的小鼠，置于装有红外传感器的标准鼠笼中，检测运动活性。由于记录时间较长，我们不仅在单居条件下进行实验，而且在群居条件下（三只或四只雄性小鼠一起在一个笼子里）进行实验，以减少慢性隔离应激。25只雄性小鼠分为八组。小鼠被允许随意获得食物和水，在单居条件下每两个月或在群居条件下每两周被转移到干净的笼子里。为了减少笼子清洁的频率，使用由α-纤维素制成并具有高吸收性的ALPHA-dri作为动物用品。在活动记录的最初几天，小鼠保持在12:12 明暗周期中。之后，动物暴露于光明和黑暗（LD）或恒定黑暗（DD）。使用红外热传感器测量运动活性，使用Clock Lab软件分析获得的自发运动活性数据。用卡方周期图计算昼夜节律节律的自由运行周期和振幅（QP值）。为了便于比较测量期间的活动水平，计算了几天的平均6分钟BIN活性，并将其显示为线图。起始强度被计算为在暗相开始之后的行为活动的峰值水平。更具体地，针对指示的周期计算平均6分钟bin活性，并将起燃后2小时内的最大6分钟bin值定义为起始强度。数据显示为SE的平均发病强度（n＝8小鼠）。在发光之前，没有小鼠表现出最大的6分钟BIN活性。

 

主动脉分析：暴露于HFD后20, 24周和28周处死小鼠，并对动脉粥样硬化病变进行分析。用戊巴比妥钠（80mg/kg ip）麻醉小鼠后，用含肝素的生理盐水（10U/ml）灌注主动脉。主动脉窦切除的主动脉标本不受周围组织的影响，纵向打开，，并钉在硅涂层的盘子上。在100%异丙醇中制备0.5%油红O原液，经0.2μm滤料过滤。将三体积原液和两体积水混合，静置10分钟，然后用0.2μm过滤器过滤，制得工作溶液。将主动脉标本固定在10%中性缓冲福尔马林中室温下15分钟，然后用50%异丙醇洗涤3次。样品在室温下在工作溶液中染色15分钟，然后用50%异丙醇洗涤5分钟。主动脉标本保存在10%中性缓冲福尔马林进行成像。使用Image J软件进行图像分析。测量每个动物主动脉病变形成的百分比，作为主动脉总面积的病变面积百分比。

 

结果：高胆固醇血症在轻度暗循环中减弱行为起始强度：为了研究高胆固醇血症对昼夜节律的影响，我们对缺乏功能性低密度脂蛋白受体（LDLR）的小鼠进行了行为学实验。这些小鼠表现出慢性高胆固醇血症，这是动脉硬化疾病的主要原因。我们使用红外线传感器记录在单室和亮暗条件下喂食HFD的Ldlr/小鼠的运动活性。以正常饲料或HFD饲喂野生型小鼠作为对照。为了研究高胆固醇血症是否通过核心时钟机制影响运动活动，我们制备了双Ldlr-/-Per2 m/m小鼠。Per2突变导致Per2蛋白中87个氨基酸序列的缺失。在单室和光暗条件下，Per2 m/m和LDLR -/-Per2 m/m小鼠也喂同样的HFD。由于长期隔离的动物在单居条件下已显示出攻击性、类似焦虑的行为和不正常的运动活动。除了单室条件外，我们还在群居条件下进行了运动试验，以减少长期的隔离应力，并确认在单室条件下所得结果的可重复性。在单室条件下，小鼠在第11天暴露于HFD。在三个时间点计算几天的平均活动水平：2-10天（暴露于HFD之前）、16-30天（暴露于HFD后不久）和56-70天（长期暴露于HFD）。在第16-30天，所有实验条件下的小鼠表现出与2-10天（正常喂食）相似的昼夜节律行为。与先前的报告一致，野生型（+HFD）小鼠在中暗期表现出行为活动减少，而其他阶段的活动不受影响。野生型（+HFD）小鼠16～30天的昼夜节律模式与Ldlr-/-小鼠2～10天的昼夜节律模式相似，与野生型（HFD）小鼠相比，野生型（+HFD）小鼠表现出更高的总血胆固醇浓度。正如最初针对靶向破坏PAR2基因的研究所报道的，Per2 m/m和LDLR -/-Per2 m/m小鼠在活动开始时表现出较早的转变。长期监测显示，Ldlr-/-(+HFD)小鼠暗期开始时的行为开始强度随时间显著降低。其活动起始强度与野生型（-HFD）小鼠相似。LDL R-/-（+HFD）小鼠在群体居住条件下发病强度的抑制更为强烈..发病强度的抑制可能归因于高胆固醇血症对昼夜节律系统的更严重破坏。表Ldlr基因敲除和Per2突变通过同一途径，即昼夜节律途径的功能失调引起发病强度衰减。

 

高胆固醇血症对常暗环境下行为节律的影响: 最初暴露于常规光和暗循环10天后，动物被置于恒定黑暗中。然后在第11天暴露于HFD，这是持续黑暗的第一天。我们没有研究高胆固醇血症对Per2 m/m和Ldlr-/-Per2 m/m小鼠昼夜节律的影响，因为它们在恒定的黑暗条件下没有表现出行为昼夜节律。野生型（+HFD）和LDLR-/-（+ HFD）小鼠暴露于持续黑暗后表现出延长的活跃期。为了比较活动模式的时间变化，活动起始时间被定义为“时间0”，在4个时间点计算几天的平均活动水平：2-10天（暴露于HFD之前）、16-30天（刚暴露于HFD之后）、56-70天和96-110天（长期暴露于HFD）.为了比较野生型、野生型(+HFD)和Ldlr-/-(+HFD)小鼠的活跃期持续时间，我们使用非线性洛伦兹曲线拟合来估计偏移前集中活动的峰值时间。暴露于恒定黑暗后，各组小鼠的活动期明显延长。然而，野生型（+HFD）和Ldlr-/-（+HFD）小鼠与野生型（-HFD）小鼠相比，在持续黑暗暴露后30天内表现出明显更长的活跃期。虽然三组小鼠均可检测到12h节律，但Ldlr-/-(+HFD)小鼠在单居和群居条件下12h振幅强度与24h振幅强度之比均显著高于Ldlr-/-(+HFD)小鼠。

 

昼夜节律紊乱可能参与动脉硬化的进展: LDLR-/-小鼠在HFD暴露后发展为高胆固醇介导的动脉硬化是众所周知的。我们目前的行为数据可能表明昼夜节律异常参与了Ldlr/小鼠动脉硬化的改变。为了研究这种可能性，我们试图通过引入Per2突变来增强Ldlr-/-小鼠的生理节律异常。Ldlr -/-和LDLR-/-Per2 m/m小鼠均饲喂HFD，比较两组之间动脉硬化的进展。已知低密度脂蛋白受体缺陷小鼠在HFD治疗后>16周显示明显的动脉斑块形成，尽管取决于饮食组成。在明暗条件下的试验数据表明，这些小鼠株（Ldlr-/-vs Ldlr-/-Per2 m/m）在HFD治疗后20周内没有检测到动脉硬化进展的差异。数据显示HFD24周后LDLR-/-Pr2 m/m小鼠病变面积显著增大。Ldlr-/-Per2 m/m小鼠未显示主动脉斑块进一步发展，而Ldlr-/-小鼠的损伤面积扩大到与Ldlr-/-Per2 m/m小鼠相同的水平。总之，这些发现表明高胆固醇血症导致动脉硬化的进展与生理节律的异常有关。

 

结论：研究表明高胆固醇血症会引起生理异常，导致社会生活质量的下降和生理相关疾病的风险增加。高胆固醇血症相关疾病的多样化和进展可能部分与生理节律紊乱有关。