基因编辑小鼠/细胞的鉴定方法之PCR

目前PCR方法因具有快速、灵敏、费用低等特点，被广泛应用于对基因编辑小鼠基因型鉴定的实验中。一般而言，针对不同基因修饰类型的小鼠，需要设计不同的引物来进行鉴定。

• 实验原理：首先，设计能与引入的外源基因结合的特异性引物，扩增原本不存在于动物基因组中的DNA序列；对于基因敲除小鼠和细胞，则在基因修饰的位置针对靶点上下游约200~300bp区域分别设计正反向PCR引物。突变型和野生型PCR产物的大小应不同，大小区别在100bp以上的，可以直接用凝胶电泳区别鉴定；若无法用凝胶电泳直接鉴定的基因型，可以将PCR产物进一步测序验证。

   

• 实验过程：提取基因修饰动物的DNA、用PCR反应扩增靶序列、琼脂糖凝胶电泳、检测DNA片段的有无和大小，进一步测序以确定基因型。具体操作步骤如下图1，我们也在往期有详细介绍（链接：基因编辑小鼠——基因型鉴定，2016-11-2）   

图1.  小鼠基因型鉴定步骤

问题来了，WB鉴定蛋白与PCR测序结果不一致怎么办？

如当我们委托第三方构建小鼠或细胞时，第三方公司提供的鉴定报告一般只包括上述提到的基因组DNA水平的PCR和测序结果，即保证在DNA 水平的敲除，并以此给出模型已经构建成功的结论！但是我们往往需要去验证蛋白的功能，因为蛋白才是生物学功能的最终执行者。这样就导致了一种现象，默认蛋白Western blot（WB）检测结果本该像中心法则那样，与基因组水平的DNA测序结果相对应，然而却发现蛋白的WB结果与DNA的PCR和测序结果不一致，我们开始慌了，这究竟怎么回事，这个模型没有构建成功？如果遇到这种问题，我们该如何处理呢？

首先，我们需明确: WB鉴定的结果不一定可靠！

1.  WB只是建立在DNA序列正确基础上检测蛋白表达的一种手段，其结果不能单方面作为鉴定结果的判断。

运用CRISPR/Cas9技术构建编辑的基因敲除小鼠或者细胞是在基因组水平对靶向基因进行了目标DNA序列的敲除（图2）。基因（Gene）是核酸分子中储存信息的遗传单位，是指储存有功能的蛋白多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列，因此蛋白的合成是在基因的指导下完成的。也就是说基因是蛋白表达的基础，没有DNA序列的改变就不会有蛋白表达的改变，所以鉴定DNA序列的改变是最为基础的。

图2.  CRISPR/Cas9 介导DNA敲除原理图[1]

2.   有WB条带不一定就代表蛋白还有功能！

基因敲除一般分为两种情况：一种是把目的基因的DNA外显子编码序列全部敲除；第二种是敲除外显子上部分编码蛋白的序列，因为敲除的外显子序列为非三的整数倍，所以这种情况会造成蛋白翻译移码突变，从而进一步实现了相应蛋白功能的敲除。因此如果通过对目标序列进行PCR和测序鉴定确定目的基因在DNA水平删除了相应DNA 序列的话，相应的蛋白就会因为缺少正确的DNA翻译模板无法合成正确的蛋白。而WB抗体本身存在一定的非特异性结合，有可能出现假阳性结果。所以，有WB条带不一定就代表蛋白还有功能。

举个例子：

有研究者曾经发表文章（WeiqunYu et al. 2013）来检验P2Y₆蛋白商品化抗体的特异性和有效性，作者依据两个标准筛选了3家公司的商品化抗体：

1）候选的抗体曾经有研究者验证过抗体的特异性并曾在公开刊物上发表；

2）候选的抗体针对P2Y6蛋白不同部位的抗原表位。

曾经使用候选抗体并公开发表的文献的实验数据和各抗体厂家的使用说明书上的资料都显示，所选的抗体在特异性和有效性上都具有很大的潜力。但是实验结果却表明WT小鼠和P2Y6基因敲除小鼠抗体检测结果并无明显差异（图3），虽然其中两种抗体在该研究者的实验之前都有不少于一篇的文献证明其他研究者使用该抗体得到了非常好的特异性和漂亮的图片结果。那造成这种不一致现象的原因可能是在不含有P2Y6的组织中，仍然存在着能被该抗体识别的其他抗原。

图3.  三种不同 P2Y6 抗体特异性检测[2]

所以，WB的结果有时并不那么可信，因此不推荐采用WB来验证！那除了PCR测序和WB验证，还有其他什么方法呢？

基因表达分为转录及翻译两阶段，转录是以DNA（基因）为模板生成mRNA的过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白的过程（图4），检测基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白的生成。所以基因表达检测分为两个水平：即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白的检测。

图4.  基因表达翻译原理图[3]

1.   转录水平上对特异mRNA的检测：

主要方法有Northern杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，也可用RT-PCR （reverse transcribed PCR）方法检测DNA的转录表达。其原理是以小鼠或细胞总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增或荧光定量PCR；如果从小鼠组织或细胞总RNA提取物中没有得到特异的cDNA扩增条带，则能从转录水平验证了基因敲除。

2.   翻译水平上对蛋白功能的检测：

主要是对蛋白生物学活性的检测，如果我们敲除的基因具有生化反应活性或其他的生物学活性，那么我们还可以通过相应的酶反应或者生物学活性来进行蛋白水平的验证。

综上所述，基因型的鉴定应以PCR测序为准，在蛋白水平的WB验证并不是判断的唯一标准，我们可以从该基因的生物活性或者RNA转录水平入手，多角度验证小鼠或细胞系的基因敲除。

参考文献：

[1] Maeder,M.L. & Gersbach, C.A. Genome-editing Technologies for Gene and CellTherapy.Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy(2016).

[2] Weiqun Yu&Warren G. Hill. Lack of specificity shown by P2Y6 receptor antibodies.Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol(2013) 386:885–891.

[3] http://203.92.44.117/mirtronPred/

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上海邦耀生物科技有限公司成立于2013年9月，是一家以基因编辑技术引领创新、探索和开发突破性的疗法、预防和治疗威胁生命的疾病、造福全人类为使命的高新技术企业，总部位于上海紫竹科学园区。邦耀生物依托在基因编辑、免疫学领域的强大技术实力和科研团队，致力于基因突变引起的遗传疾病的基因治疗、以及基因编辑与细胞治疗的研发与转化，现已成功构建通用型CAR-T的研发转化平台，并拥有两个1000平米独立的GMP中试基地，用于开展基因与细胞治疗的系列转化研究与生产；另外，邦耀下设两个独立团队，分别专注于免疫及肿瘤药物研发和CRO服务，在加速自身研发与转化的同时为客户提供优质的产品和技术服务。

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