广东省实验动物信息网

编者：资源增量是实验动物科技发展的核心任务，是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80年代以来，我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣，在实验动物资源研发工作中取得的多项开创新成果。

1988年《实验动物管理条例》发布实施，在实验动物工作规范化、法制化管理，保障实验动物和动物实验的质量，推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模型创制方面，取得了令人瞩目的成果。 

为此，借“科技资讯”之窗，陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的工作及取得的应用成果。

小型猪近交系培育及利用

——记五指山小型猪的标准化与应用成果三十年

冯书堂 北京盖兰德生物科技有限公司

众所周知，由于近交系鼠类动物遗传稳定、反应灵敏、生物学特性一致性好，同物理学精密仪器和化学分析纯试剂一样能提供更为精确、科学的检测结果，已广泛应用于生命科学众多领域，如单克隆抗体制备等，近代生命科学诺贝尔奖获得者的研究成果，几乎所有的试验均是在近交系鼠类动物模型上完成的。并由此创建了多项具有划时代意义的理论学说，带来了年收益达上亿元的生物医药价值。所以，自Clarence C. Little于1909年研究小鼠毛色基因、通过全同胞交配的方法建立了第一个近交系鼠以来，目前已培育出数百个近交系鼠、兔、鸡等动物。近交系动物已成为解决人类疑难病症和生命基础科学领域研究中不可或缺的技术平台之一[1]。猪在生殖生理、营养代谢等种质特异性与鼠类有本质的差异，较鼠类更接近人类。培育近交系猪前人已奋斗多年，据报道，1920年以后美国开始利用商品肉猪进行大规模的近交系培育研究。1936年，美国农业部组织协作组对由不同品种产生的110个实验群进行测试，其近交系数分别为0.3、0.6。第二次世界大战结束以后，英国等欧洲多国单位和公司，也相继利用商品肉猪进行大规模的近交系培育研究，但由于近交繁育导致大批仔猪死亡，繁殖力衰退严重，不得不改用半同胞或远亲交配，以维护其生产性能。截至20世纪70年代，美国Lasley于1978年曾报道猪的最高近交系数仅达到0.75。同时日本学者Mezrich等报道，利用连续的相继的兄妹或者亲代与子代交配的方法已获得F7~F9，其近交系数仅达到0.75。所以培育近交系猪十分困难，是人类为之奋斗半个多世纪的梦想[1]。 

上世纪八十年代，在我国改革开放政策阳光指引下，我国实验动物同其他行业一样，迎来发展大好局面，我国1989年《实验动物管理条例》发布实施孕育而生，我们认真学习、贯彻执行《条例》精神、付诸于实际行动，自1989年至2018年，在农业部、科技部、北京市科委、国家自然科学基金委等20多个项目先后资助下，累计先后投资约2000 万元，以1公1母五指山小型猪(Sus scrofa) (Wuzhishan inbreeding mini-pig, WZSP)为系祖，开始了实验化近交系培育，育成了国际首个经异体皮肤移植等多方法鉴定的近交系新品种。使我国在大型哺乳动物近交系猪资源创新研究中处于国际领先地位，在国内外产生了较大的影响，美国、日本、以色列、德国、韩国等纷纷要求合作研究或引种，其主要原因在于近交系猪至今未见育成报道，是特殊的动物遗传资源，具有很高的使用价值和潜在的研究意义[1、2]。

WZSP 近交系培育历经近30 年，如今恰逢《条例》发表三十周年之际，回忆整个WZSP 近交系标准化培育过程，感逐颇深：我们经历了冒雨产地山区寻找的困苦、白云山机场托运的磨难；屡配不孕的困惑、卧息猪圈等待产仔的艰辛；近交繁育带来“三高一低”不良影响的焦虑；因保种负债累累、惨淡经营；确保宝贵资源不流失、而限制发展的无奈；异地保种的成功、近交培育初获结果的自信；国家农业部、科技部等领导的重视、获多方资助、标准化研究近交系育成、创建了近交系鉴定方法与标准、建立了标准化实验猪场、促进了北京地标研发与颁布，提高了北京市乃至全国实验用猪标准化水平。标准化成果开发应用，证实了该近交系种质的先进性及优势，促进近交系成果的转让成功，促进了PERV 无传染性种群的建立，促进了近交系猪-猴角膜异种产品移植研发，促进医药生物材料研发与利用，如战地抗凝血制剂、用于新药鉴定、转基因水稻食品安全检测等方面研发，培育出人源化基因猪，猪-猴肝脏异种移植等取得重大进展。尤其是完成近交系培育与鉴定的获奖的喜悦；转让成功看到的希望，再次冲击、登入国家异种移植研究殿堂“实现梦想”更感到历史赋于的重大责任。现将WZSP 近交系标准化研究成果分述如下：

1、WZSP 濒临灭绝与异地保种历史机遇（1975-1989）

为什么搞小型猪，为什么要搞五指山小型猪？还要追索到我国改革开放初期，1983-1984 年研究者在西德学习时，有幸参观西德哥廷根小型猪（Gottengen Minieture Pig）育种中心，了解到西方国家已将小型猪大量应用于人类疾病动物模型，同时又是猪胚胎工程极好的研究对象，哥廷根小型猪已销售到多个国家和地区，于是产生了引回中国开发应用的念头。由于种种原因未能实现，在此期间，国内经历了大规模的家畜品种资源调查，发现了众多特异性畜禽品种，WZSP 就是其中一例，但已濒临灭绝[2、3]。1987 年为保护这一宝贵资源，立即购买发现的8 头纯种猪，在原通乍农业专科学校定点保存和观测，由于种种原因，1989 年再次处于濒灭境地。从资料上分析，五指山猪的小型化特征、遗传稳定性要远远好于西德哥廷根小型猪，将会具有较好的应用前景。基于这种思考，1989 年为保护这一宝贵资源，克服种种困难，将仅存留的2 头小母猪（后其中一头肠胃疾病死亡）和1 头小公猪运至北京，开始了漫长的保种和近交繁育[2]。

2、WZSP 异地保种成功，为标准化培育奠定基础（1989-1995）

在农业部畜牧总局：小型猪繁殖特性研究（09）；农业部行业重点公关：五指山小型猪选育研究（85 牧－07－03）、近交系五指山小型猪培育及开发利用研究（95 牧－02-08－03）；国家自然科学基金重点项目：实验用五指山猪近交系建系研究（39830190）等项目资助下开展了成果1：《实验用五指山小型猪种质特性及开发应用研究》。

2.1 遇到的难题

1989年5月28号 WZSP 运至北京首先遇到第一个问题，是五指山猪是否具有小型特征？是关系到WZSP有无开发应用价值的大问题！也是同行关注的焦点，当时我们也难以肯定回答，为解决此“心头雾团”，首先采取“自由采食、不限量”。两年后发现原引种猪胸围增大、但腿不增高，两年未打任何疫苗、未发生传染性疾病。表现WZSP 确具有体型小、适应能力强的特点，见图1。

异地保种遇到第二个问题，是发情不排卵、配不上种。我们采用PMSG+HCG 外源激素处理的办法解决、以及定时观测，逐步掌握了其生物特性和饲繁规律。获得妊娠并产仔，迈出了异地保种成功的第一步。

异地保种遇到第三个问题，是由于近交后代仔猪畸形率、弱仔率高，招致死亡率高、不足20%(见图2)，及时采用提高营养水平、加强运动、草场自由采食，以及改善生态环境修改暖房等措施，逐步掌握了其生物特性和饲繁规律。迈出了异地保种成功的第一步，1994年基础母猪30余头。

2.2 研究初步发现

WZSP在生长激素位点特异性，即：生长激素在动物的生长发育过程中起着十分重要的调控作用, 为此对WZSP的生长激素位点进行了初步的研究。以猪的生长激素(GH)cDNA为探针, 利用BamHI、Dral、EcoRV、HindIII、Kpnl、PstI、SacI、Smal、XbaI等酶切基因组DNA进行了RFLP分析, 结果发现酶切杂交图谱上出现差异，特异的深色带可能与WZSP在GH位点上的所代表的等位基因的结构和功能有关、尚待进一步研究。为此，利用国际合作机会，在美国耶鲁大学、佐治亚医学院对WZSP生长激素基因序列及其结构分别进行了三次测定，均具有相同的特异性。即：WZSP的GH基因序列与Vize发表的普通猪的GH基因序列有所不同处，并导致部分氨基酸的改变。这种改变对WZSP生长激素基因的结构及基因表达都可能会产生一定的影响，为后来进一步深入研究其矮小型指明方向。

2.3 WZSP具有特异性遗传标记

在WZSP特异性遗传标记研究中，对长白猪、WZSP和枫泾猪三品种的肝组织总RNA进行DDRT－PCR分析，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳共产生24条多态性cDNA 片段。在其扩增、标记和克隆后，,经Northern杂交鉴定，证明一个长221bp的片段为WZSP特有的，以克隆的特异性片段，调出其全基因进行分析和比较，为探索不品种表型差异的分子遗传基础提供一条线索、为后来进一步研究WZSP的遗传标记奠定了基础和信心。 

2.4 近交繁育推进十个世代[2、3] 

利用采用“仔配母”、“全同胞”交配等措施（见图3），继续获得F8、F9 等仔猪部分个体，提供共同参加国家自然科学基金重大项目的华西医科大学，进行适宜异种器官移植猪的筛选研究。李幼平等（2000）在研究近交系西双版纳小耳猪和WZSP DNA指纹图谱相似系数和近交系数的相互关系中证实：WZSP近交8代的DNA指纹图谱相似系数，等同于近交系西双版纳小耳猪的第12代。表明WZSP实际已近亲繁殖第18代，基因高度纯合，近交系数已达0.98。培育出我国乃至世界上第一批实验用近交系猪群，具国际领先水平。

2.5 近交繁育佐证原引2头种猪已是近交个体[2、3] 

为挽救这一濒临灭绝的猪种，我所从1987年起就开始主持原地保种、定点观察等一系列工作。本项目培育的近交系，就是从原产地定点观察后、最终存留的同窝的1公1母近交繁育而成的。但原地保种、定点观察的几头纯种的五指山猪究竟近亲繁殖了多少代已无从考证，也是WZSP在近交繁育、近交系的建立过程中要研究，而且必需回答的问题之一。原北京农业大学孟安明教授研究报道（1995），利用鸡的小微卫星cMS18探针对原引2头种猪及长白猪和枫泾猪DNA指纹图相似系数比较分析，发现原引2头种猪DNA指纹图相似系数为0.632，极显著的高于一般国内外品种猪长白猪（0.481）和枫泾猪（0.473）。按近交系小鼠每近交推进1个世代，其DNA指纹图相似系数平均提高0.02的相互关系来计算，原引种猪已是近交F7世代个体。这一结果后来华西医科大学也得到验证（移植免疫生物学，科学出版社，2000）；不仅为该近交培育准确建系奠定科学基础，也为其耐近交特性提供了科学依据。因此，依此近交基础建立该近交系是科学的。 

2.6 DNA指纹图相似系数监测[2] 

协作单位原北京农业大学孟安明教授研究报道（1995）采用33.6和33.15微卫星探针对F8、F9、F10群体监测，结果显示近交F8个体间DNA指纹图相似系数为0.678，F8与F9间的数值为0.785，F9与F10间的数值为0.855，F10个体间的数值为0.906，其步进值略大于近交系小鼠的测定报道的平均值（0.02）。 另利用9对微卫星探针对其F14、F15、F16群体（不分家系）检测，其基因座位杂合度（H）和多态信息含量（PIC）分别为0.4201、0.4035、0.3259和0.3442、0.3353、0.3008，呈现递减，即H14≥H15≥H16和 PIC14≥PIC15≥PIC16。表明随着近交世代的递增，群体的遗传变异降低，其基因的纯合度越来越高；进一步分析还发现家系Ⅱ的H及PIC分别为0.2075和0.1588，其值小于0.25，表明该家系基因已高度纯合。 

2.7分子遗传基础与种质特异性研究[2] 

通过分子遗传学特性研究，首次发现：WZSP DNA指纹图谱具有特异性；生长激素基因FRLP具有特异性位点；MHSn（应激反应）基因频率为0（0/44）；221bp片段为其具有的特异性遗传标记；WZSP生长激素基因序列与普通猪有很大差异，即：内含子区有14个碱基缺失、6个碱基错位，外显子区有3个碱基发生变化并造成了3个氨基酸残基变化；有关小型猪分子遗传学特异性研究国际尚未见报道。在国内、外首次开展小型猪分子遗传学特异性研究。首次发现： 

1）WZSP DNA指纹图谱具有特异性。 

2）WZSP MHSn基因频率为0（0/44）。 

3）分离、克隆的221bp片段（长白猪、枫泾猪无）为其分子遗传特异性标记。 

4）WZSP生长激素基因序列分离、克隆、序列测定和分析证实，与普通猪有很大差异（Vize.1990），内含子区有14个碱基缺失、6个碱基错位，外显子区有3个碱基发生变化并造成了3个氨基酸残基变化，其中有2个处于生长激素氨基酸序列的高度保守区。初步揭示了其分子遗传学特异性。为其分子遗传学鉴定标准提供了科学依据。 

5）通过生长发育规律、血液生理生化值测定、实验化培育、发现具有诸多特异性，体型小、体重轻、生长发育极为缓慢（6月龄13.43+3.27kg;24月龄36.65+9.17kg）、性成熟早、遗传稳定；并首次发现WZSP 50多种血液生理生化值近似人类、心冠状动脉前降支分布与中国人第二型（占总人数90%）相似。但白血球分类中淋巴细胞含量（75％）显著高于普通猪（52％）和人类（25-35%），可能与其有较强的伤口愈合能力有关。 李幼平等在研究选择适宜猪-人异种器官移植近交系猪中还发现：培育的近交系WZSP生理功能、药物清除功能、肝脏和心脏的生化及合成功能 、药物代谢功能等与人类相近，未发现功能明显不匹配之处[4]。 

6）通过白细胞抗原血清学（SLA）研究，首次发现其C位点出现W2抗原、B位点出现W6抗原。这种组成在其它品种猪中未曾发现：通过50多种影响肉质及风味特异性物质研究，其奎啉酸和丙二酸乙基戊基脂含量分别高于普通猪肉8倍和20倍[2]。 

2.8 研究成果创新点[3] 

将濒灭的、珍稀品种WZSP异地保种获得成功，对我国畜禽品种资源保存是一个贡献；在国内首次对WZSP进行了多方位、深层次的种质特异性研究，为今后开发利用提供了科学依据。 发现：WZSP体型小、体重轻、生长发育极为缓慢、性成熟早、耐近亲繁殖、遗传稳定；其血液生理生化值50多指标近似人类；WZSP肉中奎啉酸和丙二酸乙基戊基脂含量，分别高于普通猪肉8倍和20倍。并证实应激反应基因（MHSn）频率为0（0/44）；培育出我国乃至世界上近交系数最高、实验用近交系种猪群；在国内、外首次开展小型猪分子遗传学特异性研究。达国际领先水平。

首次发现：

1）WZSP DNA指纹图谱具有特异性。 

2）WZSP MHSn基因频率为0（0/44）。

3）221bp为其特有片段（长白猪、枫泾猪无）。 

4）WZSP生长激素基因序列与普通猪有很大差异：内含子区有14个碱基缺失、6个碱基错位，外显子区有3个碱基发生变化并造成了3个氨基酸残基变化，其中有2个处于生长激素氨基酸序列的高度保守区。 

开展了应用：在国内与解放军304医院、北京口腔医科大学、北京中医医科大学、同仁医院、北医三院、中国医科大学、中国兽药监察所、中国农业大学生物学院、兽医学院、南京农业大学等十余个单位合作，对WZSP首次进行人类烧伤修复、口腔、牙齿病理、心血管疾病模型、胰腺等细胞移植以及畜牧、兽医上的营养代谢、细菌、猪瘟病毒敏感性试验、胚胎工程等全方位、十余项内容的开发应用研究。解决了心脏血管易破裂、血管上皮细胞转染CD59基因，体外培养获得成功、人类烧伤修复药物的研制、人类口腔牙齿动力学等临床应用难题，在国内对WZSP首次进行大量的人类烧伤修复、口腔、牙齿病理以及畜牧、 兽医等十余项开发应用研究，对其开发应用价值作出了全面的评估。为今后开发利用提供了科学依据。 

在此期间，完成WZSP近交系标准化研究成果1：《实验用五指山小型猪特异性与开发利用》，1996年通过农业部组织专家的成果鉴定（1996-1975）（见图4）。

1996年11月29日《科技日报》报道WZSP实验化培育异地保种成功。 

1999年荣获农业部科技进步三等奖。

3、近交系培育标准化研究取得重大突破（1996-2005） 

近十年WZSP近交系培育与开发利用，证明培育出的近交系及其分子遗传学特异性，是人类比较医学研究的较佳素材，并具有打入国际实验动物市场的能力。已引起国内、外有专家的兴趣和关注，纷纷要求引种或合作研究。也引起我国政府部门重视。为此，实验用WZSP标准化研究得到科技部获多项资助：中国实验用小型猪资源开发与研究应用(2004BA717B)、用于异种器官移植五指山小型猪SLA及EG细胞建系研究(2003AA215103)、五指山猪近交系及油鸡资源保存和利用研究(2003DEB6J078)、我国小型猪实验化培育与生物安全性研究(2001DIA40036)，农业部五指山猪遗传资源保护项目和国家自然科学基金委五指山猪实验用近交系的建立(39830190)、国家自然科学基金重大项目：异种器官移植基础研究（No.39993430）等项目资助，为近交系培育与研究奠定了坚实基础。首先制订了WZSP近交系培育总体思路，如下图5示。

3.1 建立了近交繁育技术规程、标准化取得重大进展 

采用“仔配母”、“全同胞交配” + 分子遗传标记最大限度的提高近交速度，最大限度提高群体基因的纯合度、淘汰有害基因。通过500头次数据分析表明近交对繁殖力影响很大，F8～F9仔猪成活率极低、仔猪成活率分别为19.05%、22.22%、并伴有发情不排卵、屡配不孕、断代现象发生。为解决这一难题，采取PMSG+HCG的“诱导发情”、提高饲料营养水平（即：由原来的13%的蛋白水平提高到16%）、定期舍外运动（即：效仿原生态环境，每周放牧2－3次，每次在草丛的场地中4－6小时）等措施（见图6），逐步克服近交对其繁殖力的不良影响，即木乃伊率高、弱仔率高、死亡率高、断代率高等。但随着近交代数的增加，其仔猪成活率逐渐提高，其死胎、木乃伊比例逐渐降低，其窝产仔数亦有增加的趋势。如F14窝产仔数为5.75±1.00（n=6），仔猪成活率为66.67%（22/33），死胎、木乃伊6.06%（2/33）等。已组建WZSP实验用近交系F14-F17基础母猪群100头、公猪15头及系谱；培育的近交系较之原始种猪群具有性情温顺、遗传背景清楚、基因高度纯合、体色为黑白花、体型和毛色一致性好，较之国内外品种更具有体型小、遗传稳定等优势（见图6-11）；其近交系数高达0.974；近交系培育方法研究已获国家发明专利（ZL 02149030.9）[3、4]。

掌握了WZSP近交系生长发育规律，窝产仔5-7头，出生体均重0.33±0.083Kg(n=29)、1月龄为2.94±0.55Kg、2月龄为5.55±1.30Kg, 6月龄为13.43±3.27Kg、24月龄为36.65±9.17Kg；依据F12、F13、F14F16的初生重至6月龄体增重记录和指数曲线、logistic曲线、compertz曲线，求出其三个曲线生长公式模式，比较其拟合度、选出最佳曲线、生长拟合公式。即：拟合公式：W=4594.15e0.0063t，W为体重，t为日龄，e为常数、拟合度：0.7782、可估测其体重。表1研究结果证明，依据该公式推算出的近交系体重与实测体重大致相近，表明该近交系生长发育稳定，具有生长发育规律一致性强的特性，与原海南非近交系WZSP不仅毛色不一，而且体型也分大、中、小之分，具有显著不同(王兴龙，2005）。

3.2 建立了近交系系谱

F15前配种方式按照全同胞交配、父女交配和祖孙三世代内近交繁育。F15代后按照全同胞交配和父女二世代内交配的方式进行近交繁育。依据近交效应据资料记录统计与实际达到的理论数指结果，依据试验记录，继续完善近交系系谱(见图12）。另：其中F0世代至F15世代窝产仔等数字均为传统家养普通猪舍产仔、幼猪饲养培育的资料记录统计结果，而F16世代至F20世代窝产仔等数字部分为网上产仔、网上幼猪饲养培育的资料记录统计结果，F19世代窝产仔等数字部分为传统家养普通猪舍产仔结果。

3.3 近交佐证研究取得突破性进展

采用33.6和33.15微卫星探针对F8、F9、F10监测证实：近交F8个体间DNA指纹图相似系数为0.678，F8与F9间的数值为0.785，F9与F10间的数值为0.855，F10个体间的数值为0.906，表明随着近交代数的推进其基因的纯合度越高；利用9对微卫星探针对其F14、F15、F16群体（不分家系）检测，其基因座位杂合度和多态信息含量分别为0.4201、0.4035、0.3259和0.3442、0.3353、0.3008，呈现递减，即H14≥H15≥H16和 PIC14≥PIC15≥PIC16。表明：随着近交世代的递增，群体的遗传变异降低。分析发现家系Ⅱ的平均杂合度（H）及平均多态信息含量（PIC）分别为0.2075和0.1588，其值最低小于0.25，表明基因已高度纯合；不同染色体上9个基因位点的SNP监测结果进一步证实：该近交群体F14、F15、F16中有6个纯合，而对照组贵州小型猪、通成猪、长白和大白猪仅有1-2个位点纯合；对比研究还发现F8群体33.6探针 DNA指纹图相似系数（0.86）等同西双版纳小型猪的F12（0.86），这一结果将其实际近交代数向前推进了4个世代；F14个体间进行的皮肤交叉移植试验未见排斥反应发生。 

3.4 标准化研究开展了血液生理生化指标测定 

研究证实：该近交系42项血液生理生化指标测定高于人类最大值有10项、低于人类有3项，其余数值均处于人类参考值范围内（见表2、3）；其生理解剖、心、肝、肾药物代谢等近似人类（见图13）；经解放军309医院和北京市佑安医院测定证实，该近交系血型类似人类“O”型，较之其它品系猪更近似人类，并在开发利用中得到了验证。将该近交系20头用于猪瘟毒株试验，接种后该品系与SPF猪相比提前1-3小时死亡，与SPF猪取得了一致性的结果，表明该品系对猪瘟病毒反应敏感。

3.5 开展了种质特性及品种鉴定方法研究

分子遗传基础蛋白质、SRY、线粒体DNA、 SLA、GH、GHR等基因的SNP研究，提出了实验用猪近交系培育及质量控制建系技术方法，揭示了其遗传稳定性、与人类近似性、矮小性的分子遗传机理。 

①依据三个品系的小型猪在6个蛋白质标记等位基因频率的分布差异性，发现AKP蛋白质标记AA型，可作为该近交系与贵州、广西巴马小型猪品系间鉴定方法之一。 

②利用10个SNP位点（PNAS-4(MspI)、PNAS-4(HinI)、Pnas-4(TasI)、Pnas-4(StyI)、HUMMLC2B(Hin1I )、HUMMLC2B(MspI)、HUMMLC2B(BglI)、Calsarcin1(BseLI)、Calsarcin2(BseNI)、ADSSL(BspT)）对三个品系检测，在所检测的9个SNP位点中，WZSP近交系（F14～F16不分家系）有6个位点纯合，广西巴马小型猪、贵州小型猪、通城猪、长白猪、大白猪分别有3、2、2、1、2个纯合。 

③利用美国猪基因组协作计划推荐的第11组用于遗传多样性和亲缘鉴定研究的21个微卫星标记探针监测证实：用于三个小型猪品种准确分辨的座位有SW24，SW951，S0005，S0101，SW769，S0355，SW902，SW72，S0218，S0090，CGA。三个小型猪品种中特有等位基因共96个，其中贵州小型猪有49个，WZSP近交系有22个，广西巴马小型猪有25个，这些片段可以用作三个小型猪品种个体的遗传鉴定等10个座位上，该近交系有22个优势等位基因，可做为与贵州小型猪、广西巴马小型猪品种个体间的遗传鉴定；并发现SW936 88bp等位基因为该近交系特有的遗传标记、已申请发明专利（200510008994.2）。 

④依据微卫星探针对F15个体在S0036、SW225、SW1377位点等位基因的纯合度将群体分为三个家系。 

⑤近交系SLA研究发现：SLAⅠ类3 基因有10个新等位基因，在第7染色体上，分别为566bp、566bp、565bp、565bp、562bp、562bp、566bp、565bp、570bp、565bp（其中9个已经在GenBank注册，DQ399654、DQ399655、DQ399656、DQ399657、DQ399658、DQ399659、DQ399660、DQ399661、DQ395123），并导致相应氨基酸改变，其中9个等位基因编码的氨基酸序列在105、112和118等三个关键氨基酸残基与人的完全相同，SLA1与HLAⅠ类基因多态结合区氨基酸序列50～55%的同源性；SLAⅡ中DRA、DQB无多态性，DRB、DQA为多态性、其相应基因的核苷酸序列与我国南方人群同源性达73%至83.7%左右、氨基酸序列同源性为77%～80%左右；DRB分子和HLA-DRB分子与CD4分子结合的关键氨基酸残基序列完全相同；SLA-I类和II类基因及其氨基酸序列与NIH小型猪相比基因同源性较高，DRA均为高度保守序列、核苷酸和氨基酸水平同源性均为100%；对其它具有多态性的基因核苷酸水平同源性也高达90%以上、氨基酸水平同源性达87%以上。结果初步揭示其与人类、NIH小型猪近似性的分子遗传机理。

⑥研究发现近交系GH基因序列与正常猪种不同，信号肽编码区发现两处氨基酸替换，其对成熟GH的空间结构没有影响，但可能会影响到GH的跨膜转运；其GHR基因与普通猪序列比对发现其胞内结构域存在E381D，A409S，L556V，A580G，V601I五处突变。这些突变可能对WZSP GHR的胞内信号转导产生一定的影响，从而影响生长激素－生长激素受体－胰岛素样生长因子轴的信号级联，削弱生长激素的促生长作用。这同人的Laron综合症大部分是由GHR的缺陷引起多数突变发生在胞外结构域GH结合区，影响了GH和GHR的结合，导致GH信号转导中断取得一致性的结果；也同GHR敲除小鼠生长显著迟缓，呈现典型Laron综合症症状取得一致性的结果。初步揭示其矮小性分子遗传机理。 

3.6 标准化研究成果创新点[3] 

提出了实验用猪近交系培育及质量控制建系技术方法；揭示了其遗传稳定性、与人类近似性、矮小性的分子遗传机理，培育出理想的实验用猪，即： 

①培育出世界上首批实验用近交系猪，其近交系数高达0.974。较之原始种猪群、国内、外品种更具有体型小、基因高度纯合、体型和毛色一致性好、遗传稳定等优势； 

②该品系经DNA指纹图相似系数、SNP、皮肤移植等多方法验证、国内外亦未见报导； 

③建立近交猪繁育技术规范和生长发育指标，近交方法研究已获国家发明专利； 

④证实：近交后与人类匹配功能好、其血型类同人类O型、42种血液生理生化值、生理解剖、器官大小、代谢等近似人类； 

⑤发现其GH、GHR基因序列与普通猪不同、类似侏儒人，初步揭示其矮小性分子遗传机理； 

⑥不同染色体上9个基因位点有6个纯合；SRY基因和线粒体DNA序列同源性分别为99.83%和99.75%，远远高于其它小型猪，初步揭示其遗传稳定性分子遗传机理； 

⑦微卫星标记发现22个等位基因可作与其它品系种间的鉴定； AKP蛋白质标记AA型和SW936 88bp为近交系特有遗传标记、新的等位基因、并已申报国家专利； 

⑧SLAⅠ分析发现10个新的等位基因，9个已在GenBank登陆注册；SLAⅡ分型发现与中国南方人群有较高同源性。该结果初步揭示与人类相似性分子遗传机理。 

上述各项指标和发现也为该品系的筛选和鉴定，提供了科学依据。该项研究项目整体达到国际先进水平，近交系及相关成果达到国际领先水平。

3.7 与当时国内外同类研究、同类技术的综合比较具有先进性 

国外培育的小型猪品系虽多，但多数由多品种杂交选育而成，如格廷根小型猪，因多品种作亲本，体型较大，毛色类型参差不齐，遗传不稳定，近交系数仅为0.25～0.37，6月龄36kg，成年12月龄体重50-60kg以上，窝产仔5-6头。而本研究培育WZSP近交系，成年12月龄体重20-35公斤左右，窝产仔5-7头，体色黑白化、生物学特性明显。因此，该近交品系具有体型小、遗传稳定、性成熟早、产仔高等优势；其近交系数高达0.974，为世界上首批实验用近交系猪。国外Yucatan小型猪近交系数仅达到0.25—0.37。我国已开展近交猪研究，但查新未见更高近交系数的正式报导。该品系与国内外培育的实验小型猪体重比较具有较大优势。 

利用分子遗传学手段、皮肤交叉移植验证其准确性，对近交群体进行了蛋白质、微卫星SLA、GH、GHR、SPY、线粒体DNA等基因的SNP深入研究，国内、外未见报导。发现多个新的基因、其中9个等位基因已注册；初步揭示了近交猪繁育规律、种质特性与人类的近似性、遗传稳定性分子机理、矮小型分子机理、品系鉴定标准及方法和理论依据。利用分子遗传手段对实验用猪相关基因进行如此深入系统的研究国内、外未见报导。 

国内30多家科研单位和院所累计将该品系1500头猪用于医学、药学、畜牧兽医学各类试验研究均取得了满意的效果。因此，本项目具有起点高、创新性强、经济和社会效益明显等特点。尤其是近交群体成果较国外至少领先10年以上，已引起国外的关注、纷纷要求引种或合作研究。如：宁波道格国际有限公司2000年一次引种50头；我国不同意韩国引种之后，2002年要出资500万元进行合作研究也未得到中方同意，此外德国、丹麦、意大利、日本、以色列、俄罗斯等国均提出引种和合作的要求足，已表明该近交群将在国内、外市场具有较强优势的竞争力。 

WZSP近交系第二次标准化研究成果《五指山小型猪近交系培育及分子遗传基础特异性研究》，2005年第二次通过农业部成果鉴定，农科果 鉴字（2005）第024号；附：鉴定意见（见图14）；该研究成果《科技日报》第二次做了报道；《奇异小猪》在CCTV10播出（见图15、16）。

在此期间，WZSP近交系标准化研究成果获得省部级科技奖5项。

1、2009年 中国发明专利优秀奖 

2、2008年 北京市发明专利一等奖 

3、2007年 农业部中华农业科技一等奖

4、2006年 北京市科技进步三等奖 

5、2005年 中国农业科学院科学研究一等奖

（待续）