图1. Edwin Southern^[7]

（埃德温·迈勒·萨瑟恩）

Southern blot 实验原理及步骤‍

了解了Southern 的由来，接下来小编带大家一起学习Southern blot实验原理及步骤。

Southern blot基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。其操作过程是利用特定酶将DNA消化成片段，再进行电泳分离，然后将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA片段分子的含量（见图2）^[2]。

blot 操作过程^[2]

 

Southern blot

检测技术在模式动物制备中的应用‍

 

虽然距离这项技术发明已经过去很多年，但这项检测技术仍被广泛的应用在各种生物实验研究中。

如下图所示，为了鉴定携带条件性Satb1等位基因的供体质粒通过同源重组方式整合到小鼠的Satb1特异性位点上（见图3a），研究者们提取供体小鼠与wild小鼠肝脏基因组DNA，经限制性内切酶Eco RV (b) or Spe I (c,d)酶切，同时选择用于Southern印迹分析的DNA探针。探针位于待靶向的基因中，但在靶向载体外部设计5’与3’外源探针（5’ external probe与3’external probe）以及内源eGFP探针（GFP internal probe）。通过Southern blot检测显示，5’与3’外源探针分别与酶切后对应基因组片段发生杂交，说明供体质粒在5’与3’端与靶基因组同源重组（见图3b，d），与预期插入位置一致；经内源eGFP探针杂交显示为一条带，说明条件性Satb1等位基因以单拷贝插入到靶基因座上（见图3c）。^[3]

图3. Southern blot分析鉴定供体质粒靶向小鼠Satb1 基因座及拷贝数^[3]

那么既然说是同源重组“事件”，对于“事件”肯定有很多不确定性。如图4A所示，5’与3’同源臂均发生同源重组后，可将靶载体正确的插入到目的基因组中，获得研究所需的目的片段。当然，有的时候也会出现异常情况（见图4B），比如同源重组仅发生在5’末端，但3’末端没有发生同源重组，而是直接被插入至基因组中。在这种情况下，5’外源探针显示靶向等位基因片段符合预期，但3’端显示为野生型片段。此时，如果不通过设计同源臂外两侧DNA探针策略来验证同源重组是否正确，这很大程度上会增加后续研究的风险性。^[4]

图4. Southern blot鉴定同源重组事件^[4]

另外，在制备基因敲进和条件性基因敲除模式小鼠过程中，Southern blot检测是非常重要的一步。在我们以往的工作中，其中一例Cre定点敲进课题（如图5），Southern blot检测结果显示：小鼠1号，有明显的随机插入现象。

图5. Southern blot 检测定点敲进

Southern blot检测技术虽不是万能的，但绝对是金标准！

也有人会说：既然是随机插入，很可能插入在不同染色体，理论上就完全可以通过后续交配稀释或去除，那再多交配一代是不是就可以稀释甚至去除随机插入呢？

让我们看看事实是怎样的：依据我们大量的数据统计分析发现，采用ES细胞方式制备，大约有20%的概率有随机插入，由于ES细胞法制备中可以在细胞这一步就进行Southern鉴定，进入下一批小鼠制备的ES细胞可以确保为Southern阳性；而采用CRISPR/Cas9技术，随机插入的概率约32%，不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠，只能在小鼠水平筛除随机插入。而这32%中有14%的随机插入是无法靠交配传代去除的（见图6）。是否“随机插入”不是真的“随机”的呢？是不是像转基因一样，更多的情况是打靶载体或插入序列，会容易在目的插入位点插入多个拷贝，造成同一染色体/同一位点的多拷贝“随机”插入呢？^[8] 我们没有详细做过调研，但是接近一半可分离的随机插入比例，预示了有这种可能。而此时，只能通过Southern blot对基因组DNA特定序列定位，进而排除随机插入的风险。^[5-6]

   因此，Southern blot虽然有它自己的限制，如费用高，片段有技术极限等，但仍然是模式动物制备检测随机插入的金标准！

图6. 随机插入的概率分析^[5]

百奥赛图自主开发的基于C57BL/6小鼠胚胎干细胞的基因编辑系统具有独特的品系优势，CRISPR/Cas9技术自主研发的EGE^Ⓡ系统将同源重组率提高近20倍，并且一直坚持PCR/DNA测序和Southern blot鉴定双重质控。目前基因改造大小鼠及细胞系年制备能力>1500项，灵长类动物4种。欢迎小伙伴们前来咨询及合作！
 

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.