摘要：环磷酸鸟苷（cGMP）信号转导在卵母细胞成熟中的作用在哺乳动物中备受关注，但在鱼类中的作用尚不清楚。以斑马鱼为模型，首次在鱼类中证实了cGMP参与卵母细胞成熟，其卵母细胞成熟功能模型不同于哺乳动物。一氧化氮（NO）可调节细胞内cGMP，发现斑马鱼卵巢中均有三种NO合成酶和4种可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）表达。有趣的是，激活或抑制NO/sGC/cGMP通路在完全生长的卵泡中可以导致卵母细胞成熟。在卵母细胞成熟过程中，卵泡细胞层中cGMP水平升高，而卵母细胞中cGMP水平降低，而卵泡细胞中NO水平升高，但在卵母细胞中保持恒定。基于斑马鱼的这些发现，我们提出了一个关于cGMP在卵母细胞成熟中的双重作用的假想模型：在卵泡细胞中，LH信号可增加诱导卵母细胞成熟的NO和cGMP水平，而在卵母细胞中，降低的cGMP水平也可诱导卵母细胞成熟。这些发现有助于我们了解鱼类卵母细胞成熟的分子机制。

 

 

简介：卵巢的发育受到各种激素和局部因素的精确调控。卵母细胞发育过程中前期I期和中期II期发生两次发育停滞。减数分裂细胞周期从早期I期到中期II期称为卵母细胞成熟，发生在可受精卵母细胞排卵之前。从垂体分泌的促黄体生成激素（LH）触发卵母细胞成熟的恢复。近年来，环磷酸鸟苷（cGMP）在卵母细胞成熟过程中的作用引起了广泛的关注。LH处理或自然卵母细胞成熟过程中，体细胞和卵母细胞内cGMP水平均降低，提示cGMP水平与卵母细胞成熟之间存在功能关系。许多功能研究表明cGMP在卵母细胞成熟中的作用。因此，体细胞产生cGMP是维持I期前期停滞所必需的关键成分。鸟苷酸环化酶激活剂(如一氧化氮[NO]和钠尿肽[NP])可调节颗粒细胞中的cGMP。许多研究表明NO系统通过调节cGMP参与哺乳动物卵母细胞的成熟。所有这些发现都支持了cGMP信号在调节卵母细胞成熟中的重要作用，然而，大多数信息来自于哺乳动物的研究。本研究以斑马鱼为模型，探讨cGMP信号在鱼卵母细胞成熟中的作用。

 

材料：成年雌性斑马鱼，26-28℃的循环淡水水族箱，14小时光照/10小时黑暗周期。新孵出的盐水虾每天喂鱼两次。RNA分离与RT-PCR：用TrIZOL试剂分离斑马鱼卵泡总RNA。用分光光度计测定RNA的量和纯度。如上所述进行RT-PCR。免疫染色：收集成年斑马鱼卵巢，在4°C下用4%多聚甲醛（含5%蔗糖，pH7.4）固定一夜。在冷冻切片机上切割厚度7μm。

 

卵泡分离与孵化：安乐死后从15到20只雌性斑马鱼中分离出卵巢，并置于含有60%Leibovitz L-15培养基的100mm培养皿中，接受GVBD的卵泡通过卵质清除（由于卵黄生成素的蛋白水解裂解）进行鉴定。与其他研究一样，本研究中自发卵母细胞成熟率在不同批次的实验中有很大差异，这可能与斑马鱼的卵巢条件有关。因此，每次实验至少重复三次。

 

卵巢滤泡细胞的原代培养：简言之，在28°C和5%CO2条件下，选择15～25只雌性卵母细胞卵泡，在M199培养基和10%胎牛血清（FBS）中培养6d。在激素和药物治疗之前，细胞以每孔10万细胞的密度在24孔板中继代培养24h。

 

成年斑马鱼腹腔内注射：在禁食和麻醉后，斑马鱼被迅速放在琼脂凝胶板上。采用显微注射系统，3μl hCG（5IU/μl）被小心地注射到骨盆鳍之间的中线。注射后，鱼立即被转移回水族馆恢复。

 

卵泡细胞与卵泡卵母细胞的分离：用细镊子将卵泡细胞层从卵泡中仔细剥离，而不损伤卵母细胞。将分离的卵泡细胞层和裸露但完整的卵母细胞汇集在一起，分别进行NO和cGMP检测。去核的卵母细胞也用碘化丙啶（PI）染色，以证明卵泡细胞层被完全去除。用荧光显微镜观察。

 

环磷酸鸟苷浓度采用cGMP酶免疫分析法（EIA）试剂盒测定。从80个卵泡中分离出40个卵母细胞和卵泡细胞，收集20个完整卵泡，用PBS洗涤3次，抽吸PBS。基于0.69mm的估计平均直径，计算卵泡和卵母细胞中的cGMP近似浓度。由于斑马鱼卵母细胞周围的卵泡细胞非常薄，机械切割的裸卵细胞的体积与完整卵泡的体积相同。由于这些原因，在图表和文本中给出的cGMP绝对浓度应被视为近似值。用一氧化氮评估试剂盒测定细胞的一氧化氮浓度。在冰上用1ml注射器将80个卵泡中的20个完整卵泡、20个剥落的卵母细胞或卵泡细胞在PBS中匀浆。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定这些样品的蛋白浓度。NO水平的测定遵循制造商的说明书。用紫外分光光度计在550 nm处测定各样品的吸光度。用标准NaNO2溶液（0.1-100μM）生成的校准曲线测定样品中一氧化氮的浓度。

 

结果：激活NO/sGC/cGMP信号可促进斑马鱼卵母细胞成熟：为了检测一氧化氮（NO）系统是否在卵巢中有功能，在斑马鱼中鉴定出三种NOS（nos1、nos2a和nos2b）。作为经典的NO传感器，斑马鱼体内有四种可溶性鸟苷酸环化酶(sGCs，包括gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2和gucy1b3)。结果表明，斑马鱼卵巢中均可检测到三种NOS和四种sGC的转录。为了分析NO/sGC/cGMP信号转导在卵母细胞成熟过程中的作用，我们用一系列药理学药物来激活NO/sGC/cGMP。其中包括两个NO供体(SNAP和NOC-5)、两个sGC激活剂(原卟啉IX和YC-1)和两个膜渗透性cGMP类似物(8-Br-cGMP和db-cGMP)。我们发现，这些激活剂可以剂量依赖性地显著促进卵母细胞的成熟。这些结果清楚地表明NO/sGC/cGMP信号转导的激活可导致卵母细胞成熟。

 

阻断NO/sGC/cGMP信号可刺激斑马鱼卵母细胞成熟：为了证实NO/sGC/cGMP激活剂对卵母细胞成熟的影响，用NO和sGC抑制剂阻断NO/sGC/cGMP信号传导。由于该途径的激活可导致卵母细胞成熟，我们推测阻断该途径后，卵母细胞成熟会受到抑制。本研究采用三种NOS抑制剂（AG、1-NAME和乙烯基-L-NIO）、一种NO清除剂（PTIO）和一种sGC抑制剂（ODQ）进行研究。令人惊讶的是，我们发现，卵母细胞的成熟可以显著地诱导，但不会被这些抑制剂以剂量依赖的方式阻断。这些结果表明阻断NO/sGC/cGMP信号可以促进斑马鱼卵母细胞的成熟。

 

斑马鱼卵母细胞成熟过程中LH动态调节NO和cGMP：为了阐明NO/cGMP在卵母细胞成熟中的作用，观察了卵母细胞成熟过程中NO和cGMP的变化。我们已经建立了一个体内系统来研究斑马鱼卵母细胞成熟。注射HCG（15 IU/FISH）可动态诱导卵母细胞成熟。将完整排卵前卵巢卵泡人工切割成卵泡细胞和卵母细胞。碘化丙啶（PI）染色证实了清晰分离。使用这两种系统，NO浓度由一氧化氮评估试剂盒进行评估。注射hCG后0.5h完整排卵前卵泡和卵泡细胞室NO水平显著升高，而注射hCG后去顶卵母细胞NO水平不变。进一步用原代培养的斑马鱼卵泡细胞评价LH对NO的调节。结果表明，15IU/ml hCG处理0.5h可显著提高NO水平。这些结果表明，斑马鱼卵泡细胞中NO水平可被LH信号上调，而卵母细胞中NO水平无上调。利用相同的体系，进一步分析HCG对cGMP的调节作用。用竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）检测正常排卵前卵泡和裸卵细胞中cGMP水平，发现注射hCG（15IU/fish）后卵泡细胞间cGMP水平显著升高。20IU/ml hCG处理0.5h后，原代培养的卵泡细胞中cGMP水平也明显升高。用cGMP抗体免疫染色进一步证实卵泡细胞中cGMP水平的上调。cGMP信号主要定位于滤泡细胞层，注射hCG(15IU/fish)后1.5h cGMP信号明显增强。这些结果表明，LH可提高卵母细胞中NO和cGMP的浓度，但使卵母细胞成熟过程中cGMP水平降低。

 

结论：以斑马鱼为模型，我们首次在鱼类中证明cGMP参与卵母细胞的成熟。基于我们在斑马鱼身上的发现，我们提出了一个关于cGMP在卵母细胞成熟中的功能作用的假想模型：LH信号通过提高卵泡细胞中的NO水平来增加cGMP，这可以刺激卵母细胞成熟，而卵母细胞中的cGMP降低也可以触发卵母细胞成熟。这些结果为cGMP信号通路在卵母细胞成熟中的作用提供了有价值的信息。