摘要：肝脂肪变性是酒精性肝病（ALD）的早期阶段，可进展为脂肪性肝炎、纤维化甚至肝硬化。虎杖苷具有保肝抗炎作用。为探讨虎杖苷是否减轻酒精性肝损伤并阐明其分子机制，将受精后4天的斑马鱼幼鱼暴露于350mmol/L的酒精中32h，然后用虎杖苷处理48h。油红O、尼罗红H&E染色分析肝脏病理改变。用定量PCR方法检测mRNA水平，用H2O2特异性荧光探针检测抗氧化能力。虎杖苷可明显减轻肝脏脂肪变性，降低酒精和脂代谢相关基因的表达水平，包括CYP2Y3、CYP3A65、HMGCRa、HMGCRb和FASN。此外，根据荧光探针，虎杖苷抑制肝脏的氧化应激。此外，DNA损伤相关基因（CHOP、GADD45αa）表达显著上调，表明虎杖苷可抑制幼虫肝细胞凋亡。综上所述，虎杖苷可通过减轻肝脏脂肪堆积、改善脂质和乙醇代谢、减少氧化应激和DNA损伤等改善斑马鱼急性酒精性肝损伤的肝功能。

 

 

简介：酒精性肝病(ALD)是由于饮酒过量引起的，包括肝脏组织的一系列疾病和病理变化，从单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎，到纤维化和肝硬化。酒精滥用所致的肝脂肪变性是ALD的早期阶段，并可能易患更严重的ALD。近几十年来，ALD已成为世界范围内肝硬化和肝相关疾病发病率和死亡率的主要病因，国内外对该病的研究较多，主要通过建立长期酒精暴露的动物模型来研究慢性肝损伤。急性暴露于酒精也可导致炎症性肝损伤，其发病机制尚不清楚。此外，由急性饮酒引起的酒精性肝炎的流行率也增加了。现有的ALD治疗并不完全令人满意。前期研究短期口服虎杖苷可通过抑制酒精暴露大鼠的氧化应激和炎症反应减轻肝脏损伤。虎杖苷具有抗氧化、脂质过氧化和抗凋亡的特性。此外，虎杖苷可显著降低高脂血症家兔血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平。目前的研究旨在确定虎杖苷对常规动物模型中慢性ALD的疗效。然而，虎杖苷抗急性酒精性肝损伤的作用机制尚不清楚。斑马鱼由于胚胎的快速和外部发育、短世代时间、低成本以及82%已知人类疾病基因的已鉴定直系同源性，已成为生物医学研究的主要模式。此外，斑马鱼幼虫的光学清晰度和大群集在脂肪肝疾病药物筛选中具有普遍的优势。鉴于目前尚无特效药物及急性酒精性肝损伤的可能机制，我们对斑马鱼幼体进行了初步研究。我们评估了代谢乙醇的主要酶，包括细胞色素P450、家族2、亚家族Y、多肽3(CYP2Y3)和细胞色素P450、家族3、亚家族A、多肽65(CYP3A65)。此外，还检测了在脂肪酸的细胞内结合和转运中起关键作用的三个基因HMGCRa(HMG辅酶A还原酶a)、HMGCRb(HMG辅酶A还原酶b)和FASN(脂肪酸合成酶)。由于氧化应激是酒精性肝损害发生和发展的关键因素，因此使用H2O2特异性荧光探针检测H2O2的产生，H2O2是一种可导致氧化应激过度产生的活性氧，研究了虎杖苷对氧化应激所致ALD的作用机制。此外，检测CHOP（C/EBP同源蛋白）和GADD45αa（生长抑制和DNA损伤诱导的45α，a）对虎杖苷的抗凋亡作用。

 

材料和方法：本研究中使用的斑马鱼菌株是野生型斑马鱼(AB株)和具有肝脏特异性eGFP表达的转基因系[Tg(lfabp10α-eGFP)]。成年斑马鱼在28.5℃饲养，每天喂两次。将4dpf的斑马鱼幼鱼随机分为对照组和模型组。对照组在滤过鱼水中饲养，模型组在28.5℃下暴露于350mM乙醇（2%EtOH）32h。将溶解在二甲基亚砜（DMSO）中的虎杖苷单体用过滤鱼水稀释，得到三种浓度（6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml）。乙醇暴露后，幼虫进一步分为6组：正常对照组、模型组（鱼水处理组）、0.1%二甲基亚砜组、虎杖苷干预组。然后将其置于密度为25只幼虫/孔的6孔板中，在28.5℃下孵育48小时，然后采集幼虫进行检测。

 

石蜡切片H&E染色：在4℃下用4%多聚甲醛(PFA)收集并固定一夜后，用逐渐升高的乙醇、二甲苯代替、石蜡包埋、切成3-5μm的切片，进行H&E染色。然后用光学显微镜对样品进行观察。

 

油红O染色：将幼虫固定在4℃的4%PFA中过夜，然后用1×磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤3次。分别用20%、40%、80%和100%丙二醇浸泡幼虫15分钟。然后在65℃下用0.5%油红O对幼虫进行1小时的染色，避光。样品在绝对丙二醇中漂洗40分钟，然后分别在80%、40%和20%丙二醇中孵育20分钟。 随后，样品用PBS彻底洗涤后储存在70%甘油中。最后，用解剖显微镜对幼虫进行观察，确定为脂肪变性。

 

冷冻切片油红O染色：幼虫在4℃下用4%PFA隔夜固定，在PBS中洗涤，在30%蔗糖中平衡4天。随后，将样品嵌入OCT中，在-20℃的近似温度下冷冻，切片15μm。其次，将切片干燥，用蒸馏水冲洗。将切片浸入100%丙二醇2后，每片5分钟，切片在60℃下的油红O溶液(0.35g油红O溶于50mL丙二醇)中孵育7分钟，避光。随后，将其浸泡在85%丙二醇中3分钟，并用蒸馏水冲洗。封片观察。

 

尼罗红染色：将0.5mg尼罗红溶于1mL丙酮中,用75%甘油和25%水稀释,制得尼罗红原液。幼虫用4%PFA固定一夜后置于96孔板中。然后，用PBS洗涤样品，用0.1%Triton在65℃的柠檬酸溶液中渗透2小时。然后，用PBS洗涤幼虫，用DAPI染色细胞核20分钟，避光。用PBS洗涤DAPI后，在室温下用尼罗红工作液对肝实质中的脂滴进行染色30分钟。在共聚焦显微镜上拍摄了染色幼虫的图像。

 

RNA提取与定量实时PCR(qPCR)：使用TRIzol试剂从幼虫中分离总RNA，并按照制造商的规格使用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录为cDNA。根据生产厂家的说明，在Light Cycler 96系统上使用与引物配对的SYBR Green试剂盒进行qPCR。

 

过氧化氢检测：用荧光探针DHR 123测定H2O2。用虎杖苷处理48h后，随机选择每组8只幼虫，并进一步分成2组：DHR 123干预组和未处理组。然后用鱼水冲洗幼虫3次。在接下来的步骤中，避光保护样品。将DHR 123在鱼水中稀释至10μmol/l作为工作溶液。随后，将探针组的幼虫在稀释的工作溶液中孵育，而未处理组在鱼水中孵育，在28℃下孵育10分钟。清洗幼虫并使用2mg/ml的曲卡因麻醉，然后将它们放置在先前用甲基纤维素覆盖的玻片上。最后，在荧光显微镜下观察和拍摄它们。

 

结果：斑马鱼幼虫酒精性脂肪肝病：在鱼水中加入350mM乙醇32h，造成肝脏损伤，以区别于乙醇引起的慢性肝损伤。以往的研究表明，经350mM乙醇暴露32h后，斑马鱼幼虫大部分出现形态学表型和肝肿大。为了研究乙醇对肝脏形态学的影响，我们进行了H&E染色，显示乙醇组肝细胞由正常对照组向大量脂肪滴肝细胞转变。油红O染色可见肝肿大和脂肪变性。尼罗红染色显示斑马鱼幼鱼乙醇暴露后肝组织脂滴蓄积。

 

虎杖苷对乙醇诱导的斑马鱼肝脂肪变性的缓解作用：H&E染色显示乙醇暴露组出现明显的病理改变，包括细胞索紊乱、白细胞浸润和脂质滴沉积。尼罗红染色是一种检测细胞内脂质颗粒的荧光染料，用于评价虎杖苷是否抑制乙醇暴露后Tg(lfabp10a：eGFP)幼虫肝脏脂肪变性的发展。添加虎杖苷后，幼虫肝实质中脂滴的数量和大小明显减少，而乙醇组则明显减少。此外，我们利用ImageJ软件将油红O染色照片转换成灰度值进行量化。结果表明，虎杖苷治疗组肝脂肪变性程度明显减轻，尤其是25μg/ml组。

 

虎杖苷改善斑马鱼幼鱼乙醇代谢的研究：肝脏是乙醇代谢的主要器官。细胞色素P450家族2亚家族E成员1（CYP2E1）是酒精代谢的主要酶，在肝脏中表达。斑马鱼CYP2Y3基因与人类蛋白43%相同，在斑马鱼中显示出CYP2E1同源物。CYP2Y3上调导致斑马鱼肝脏氧化应激和脂肪变性增加。qPCR结果显示，乙醇暴露组CYP2Y3升高，而对照组和虎杖苷治疗组CYP2Y3降低。斑马鱼基因CYP3A65（细胞色素P450，家族3，A亚家族（CYP3A））也获得了类似的结果，该基因转录于肝脏，参与内源底物和外源物质的代谢。虎杖苷可改善乙醇代谢，减少有毒物质。

 

虎杖苷改善斑马鱼幼鱼脂质代谢及预防急性酒精性肝脂肪变性：虎杖苷可减少肝细胞内脂质滴沉积。为了进一步研究虎杖苷对脂肪代谢和脂肪性肝炎的分子机制，我们检测了肝脏中胆固醇合成的限速酶HMGCRa和HMGCRb的mRNA水平。此外，我们还检测了脂肪酸合成相关基因FASN。数据表明，酒精暴露组HMGCRa、HMGCRb和FASN的mRNA水平显著升高，而虎杖苷治疗组显著降低。表明虎杖苷可改善斑马鱼肝脏脂质代谢，介导脂质稳态，保护斑马鱼幼鱼免受酒精性肝脂肪变性的侵害。

 

虎杖苷抑制氧化应激：ROS的过度生成扰乱了体内平衡并导致氧化应激，氧化应激通过诱导不可挽回的DNA损伤、蛋白质羧化、脂质氧化和控制正常生物学功能的调节途径来触发肝损伤。荧光分布主要见于肝脏，模型组较对照组和虎杖苷干预组荧光较弱，模型组荧光较强。结果表明，乙醇诱导斑马鱼肝脏氧化应激，而虎杖苷具有较强的抗氧化能力，是预防斑马鱼ALD和氧化应激的有效方法。

 

虎杖苷降低乙醇诱导的斑马鱼幼虫内质网应激和DNA损伤：内质网（ER）应激和DNA损伤在脂质稳态、代谢和肝功能破坏中起重要作用。C/EBP同源蛋白(CHOP)的产生是ER应激途径的下游组成部分，可触发ER应激诱导的细胞凋亡。CHOP又称生长抑制和DNA损伤诱导基因153(GADD153)。此外，生长停滞和DNA损伤诱导的45α，a（GADD45αa）据报道在DNA损伤后被上调。我们发现补充虎杖苷可逆转酒精组CHOP和GADD45αa mRNA水平的升高。结果表明，虎杖苷可改善酒精诱导的斑马鱼幼鱼ER应激和DNA损伤。

 

结论：综上所述，我们发现虎杖苷抗急性酒精性肝损伤的机制与改善乙醇代谢、促进脂质代谢、降低氧化应激、DNA损伤和凋亡有关。进一步的临床前研究需要验证虎杖苷对急性ALD的有益作用。此外，将ROS荧光探针与斑马鱼幼虫结合，可以有效地开发具有抗氧化应激生物活性的天然药物。