摘要：Bruch膜通透性的改变在老年性黄斑变性（AMD）发病机制中起重要作用。本文研究了荧光乳胶珠在视网膜下注射后通过Bruch膜的迁移过程。

 

方法：33只3月龄猪41只健康眼视网膜下注射0.5、1.0、2.0或4.0μm荧光乳胶珠。注射后3小时至5周用眼底照片和组织学进行评估。在光学显微镜下用罗丹明滤镜在未染色的组织切片上鉴定荧光珠。

结果：荧光乳胶珠在视网膜下空间重新定位。脉络膜、巩膜和巩膜外腔均可见到2.0μm的完整小珠。在脉络膜和巩膜外血管中也发现较小的乳胶珠。相比之下，4.0μm的大珠没有通过Bruch膜。

 

结论：视网膜下注入2.0μm的珠能完整地通过Bruch膜，并穿过血眼屏障。在脉络膜、巩膜和血管内发现完整的乳胶珠。这些结果为探讨视网膜下清除和Bruch膜通透在AMD发病中的作用提供了依据。

 

 

简介：Bruch膜是一个5层结构，作为视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜毛细血管的基底膜。研究表明，BM中沉积物的积累先于年龄相关性黄斑变性（AMD）。这些沉积物被认为是导致BM堵塞的原因。由此导致跨BM的物质运输减少导致疾病。然而，穿越BM的传输机制还不是很清楚。有充分文献证明RPE能够通过吞噬作用运输液体和去除脱落的感光细胞外段。RPE细胞与顶端和基底特异转运蛋白之间的紧密细胞间连接维持视网膜下容积和组成。液体通过水通道在视网膜下注射后数小时内被吸收。葡萄糖、脂肪酸和氨基酸等营养物质从血液传输到光感受器也受到RPE的调节。然而，这种调节也必须涉及Bruch膜，因为膜位于绒毛膜毛细血管和RPE之间。关于Bruch膜穿越的知识仅限于小分子的体外研究。体外实验表明，膜的导水率和脂质渗透率均随年龄的增长而降低。体外研究还表明，Bruch膜减慢了模型蛋白从绒毛膜毛细血管到RPE的传递。小分子(<1.0-6.15_nm)在Bruch膜上的扩散也已在体内进行了描述。在本研究中，我们报告了在活体猪模型中，RPE如何吸收各种尺寸和直径高达4μm的较大珠。直径高达2μm的乳胶珠通过Bruch膜，在脉络膜、巩膜、眼外组织和血管内发现完整乳胶珠。

 

方法：动物和麻醉：该研究包括33头家猪的41只健康眼睛。8只猪的双眼都做了手术。12只左眼视网膜下腔注射0.5μm荧光珠标记的RPE细胞。将0.5、1.0、2.0或4.0μm的荧光珠视网膜下注射到33只猪的41只眼内。分别于注射后不同时间点摘除猪眼进行组织学观察。实验分三步进行，各组动物数量和评价时间不同。第一步，将0.5μm小珠注入视网膜下空间，并在术后数周进行评估。第一步发现少量的乳胶珠，第二步的评价时间从几周缩短到几小时或几天，乳胶珠尺寸增加到2.0μm。在第二步中很容易识别乳胶珠，并且在第三步注射>0.5μm的乳胶珠后评估。麻醉前18小时，动物被禁食，但可以自由饮水。动物被预先麻醉，并且如前所述，两眼均散瞳。气管插管后，用0.5l/min 100%氧气和2.5l/min大气空气人工通气。脉搏和呼吸频率保持恒定。通过气管插管，2.5-3.0%异氟醚维持麻醉。麻醉期间动物输注生理盐水，并保持体温。同时进行心率，心电（ECG）、温度、二氧化碳和氧饱和度的监测。如果眼部稳定不足，静脉注射1ml神经肌肉阻滞剂（2mg/ml Nimbex）。手术前，眼底照片是通过蔡司FF450 plusIR获得的。所有猪均行三孔玻璃体切除，然后进行局限性玻璃体后脱离。用等渗盐水稀释荧光珠（每只眼睛一个尺寸），然后通过41G针将0.2ml注入视网膜下空间，造成视网膜脱离。对于短期随访（3-6小时）的实验，使用未治疗的对侧眼（右眼），在最后评估日进行手术，在整个过程中将猪麻醉。

 

组织学：取眼后进行组织学检查。由于OCT具有2_μm以上的分辨率，因此不允许进行单珠检测，因此不进行OCT的体内检查。眼用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋（34眼）或冰冻切片（7眼）。为了排除石蜡包埋过程中乳胶珠的破坏，采用了两种不同的制备方法。分离出包含视盘和滤泡区域的片段，切片5um厚。为了排除切片过程中刀对珠的机械位移，从玻璃体和巩膜侧交替切取冷冻标本。所有石蜡包埋标本均从同一侧切取。其余切片用H&E染色。荧光珠只能在光学显微镜下用罗丹明滤光片在未染色切片上鉴定。所有标本都通过荧光血管造影和组织学检查来评估脉络膜新生血管（CNV）是否是Bruch膜破裂的征兆。所有未染色的切片检查特定层中珠粒的存在。然后对1μm组进行半定量评分，其分布模式代表0.5μm和2.0μm组。不同分布模式的4μm组也进行了半定量评分。为了进行半定量分析，在距注射部位每个方向20μm、50μm和100μm的距离处对6个切片进行评分，并算出平均珠粒数。为了分析吞噬细胞，用巨噬细胞标记物CD68PGM-R、CD68PGM1 M1和CD68KP1 M1对每只动物的一个代表性切片进行染色。为了分析珠粒的位置与RPE的关系，用上皮标记CK-AECAM M1对每只动物的一个代表性切片进行染色。

 

结果：注射的荧光珠从视网膜下空间重新定位。组织切片的切割方向（从巩膜或玻璃体侧）和保存方法都不影响乳胶珠的分布。不依赖于大小，在所有标本中，在视网膜和玻璃体内都能发现乳胶珠。无法确定这些乳胶珠是真的穿过了视网膜还是仅仅进入了视网膜。没有动物出现视网膜脱离，在任何组织学标本中都没有CNV的迹象，因此所有眼睛的Bruch膜都完好无损。

 

2μm以下的珠粒分布：注射后数小时，脉络膜、巩膜和巩膜外腔内发现大小可达2μm的珠状物。在视网膜下腔、玻璃体内和巩膜外腔的吞噬细胞内也观察到了乳胶珠。三种不同的巨噬细胞标记物对这些吞噬细胞没有染色。在脉络膜血管和脉络膜外血管中观察到一些小珠。

 

4μm微珠的分布：注射后1周，视网膜下腔内可见较大的4.0μm小珠。注射后两周，大部分乳胶珠出现在RPE/Bruch膜上。用RPE标记CK-AECAM M1染色的组织切片不能鉴定荧光珠。为了评估乳胶珠相对于RPE的位置，因此在染色部分上叠加未染色的邻近部分。Bruch膜下层(脉络膜、巩膜和巩膜外间隙)未见4.0μm小珠。视网膜下注射后，视网膜下间隙和视网膜色素上皮均可见大量4.0μm小珠。

 

讨论：我们证明直径达2μm的乳胶珠在体内通过Bruch膜，在猪眼脉络膜、巩膜和巩膜外组织中可发现完整的乳胶珠。在生物学尺度上，2μm等于光感受器外区(POS)的大小。随着注射后时间的延长，视网膜下间隙内的小珠数量减少。可以推测，这种减少是由于视网膜下空间中的小珠的简单退化造成的。注射后不同时间脉络膜和巩膜内均可见≤2.0_μm小珠。尽管这并不排除一些乳胶珠在视网膜下空间的降解，但是它表明完整的乳胶珠在RPE/Bruch膜上从视网膜下空间重新定位。这种重新定位的一个可能的解释可能是在组织学标本的切割过程中，离体珠的机械位移。理论上，这些乳胶珠可能已经被用于制备组织学标本的刀从视网膜下空间压出。在玻璃体和巩膜两侧交替切取标本，与切取方向无关，在脉络膜、巩膜及巩膜外间隙均有小珠形成。因此，这些乳胶珠的机械位移不太可能解释脉络膜内外完整的乳胶珠。视网膜下空间中乳胶珠的时间相关减少也强调了乳胶珠的重新定位必须在活体动物中发生。可以推测，这些小珠可能通过视网膜下手术引起的Bruch膜微破裂而逃离视网膜下空间。这种在Bruch膜上的破口将导致脉络膜新生血管形成（CNV）。在我们的任何组织学标本中都没有CNV，因此我们得出结论，在Bruch膜中没有破口。因此，这些乳胶珠必须经过了完整的Bruch膜。这些乳胶珠在脉络膜和巩膜外血管中也完好无损。因此，可以推测这些乳胶珠没有通过Bruch膜，而是通过视网膜血管离开视网膜下空间。我们不能完全排除这种情况的发生，但似乎不太可能。如果乳胶珠通过体循环到达巩膜和脉络膜，它们必须首先进入视网膜血管，通过体循环，然后离开脉络膜血管和巩膜外血管。这种分布途径在视网膜下注射后不太可能传递脉络膜和巩膜中观察到的珠粒数量。我们对刚好在Bruch膜和脉络膜交界处的乳胶珠的观察进一步支持了RPE/Bruch膜的通过。考虑到RPE的结构，大到2μm的物质能够通过。由于RPE的细胞旁阻力是跨细胞的10倍，所以乳胶珠最有可能通过RPE细胞。这个假设得到了我们对RPE细胞内珠粒的发现的支持，其他人也观察到了这一点。RPE具有吞噬作用，这一过程可以解释珠粒是如何在细胞中内化的。本研究表明RPE/Bruch膜上的转运机制受大小限制。视网膜下注射后不久，脉络膜和巩膜内可见小珠≤2.0μm，结果显示脉络膜或脉络膜外没有4μm的乳胶珠。然而，注射珠粒数量的减少不能解释不同的分布模式，因为珠粒在不同隔室中的比例发生变化。因此，在RPE/Bruch膜上的通道似乎只限于≤2.0_μm的元素，较小的乳胶珠通过Bruch膜的通道可以是被动的或主动的。被动运输涉及乳胶珠可以穿透Bruch的膜，而不损害结构。Bruch膜富含弹性蛋白，并表现出随着老化而弹性降低的特性。随着年龄的增长，Bruch膜中弹性性质的损失可能对Bruch膜的通过构成限制。这种对Bruch膜通过的限制将导致沉积物在视网膜下空间和邻近结构中的积聚。因此，AMD中的Drusen可以表示被刚性Bruch膜保留的沉积物。因此，在AMD的发育过程中应考虑Bruch膜的老化。

 

结论：在年轻、健康的眼睛中，小于4μm的完整分子可以通过RPE细胞和Bruch膜。未来的研究应探讨老化引起的Bruch膜转运机制和可能的转运改变。