摘要：我们的血管系统在体内平衡和疾病中起着不同的和关键的作用。?近几十年来，斑马鱼的使用把我们对血管发育的理解带入了新的领域，确定了控制血管形成的新基因和机制，并允许对形成发展中的血管系统的细胞和分子事件进行前所未有的观察。我们强调了控制斑马鱼血管系统形成的关键机制，并调查了来自这个高度可处理的模型系统的知识如何影响我们对人类血管疾病的理解。

 

 

简介：复杂血管系统的形成是胚胎发生过程中最早的基本步骤之一，在整个生命过程中，血管系统在组织内稳态和疾病中发挥着不可或缺的作用。近几十年来，我们对脊椎动物血管形成的理解已经显著增长。这来自于老鼠、鸡、青蛙和其他模型的发育研究。斑马鱼系统为发现控制血管发育的基因和途径提供了肥沃的土壤，以及利用实时成像来可视化血管形成的独特能力。我们将血管系统的形成看作一个渐进的、逐步的过程，中胚层祖细胞在血管生成过程中分化为内皮细胞（ECs），早期的动脉和静脉被进一步的动脉-静脉分化过程所限定。随后，血管生成和淋巴管生成的重复过程扩展了器官和组织形成过程中的血管网络。在每个水平上，分子和细胞机制促进或限制细胞迁移、增殖、细胞粘附和血管形态发生。在发育和功能血管时，需要离散的机制来控制完整性、功能和内皮细胞对流动的响应。在这篇综述中，我们调查斑马鱼模型对我们当前对血管发展的理解的贡献。

 

血管生成与动静脉分化：血管新生，定义为血管的从头形成而不依赖于预先存在的血管，在受精后12小时（hpf）的早期斑马鱼胚胎中开始，此时侧板中胚层中的细胞被指定为成血管细胞并开始向中线迁移。血管母细胞最初是如何被指定的，它们如何与其他中胚层细胞分开成为内皮细胞？二十多年来，cloche基因一直被认为是EC和造血发育的工具。就ECs和血细胞的联合作用而言，突变表型是最严重的，同时心肌细胞数量增加。cloche最近被证明编码一个基本的螺旋-环-螺旋- PAS转录因子，Npas4l，它在内皮细胞和造血前体中瞬时表达。在cloche/npas4l突变体中，外源表达的Npas4l诱导etv2和scl/tal1的表达，而两个转录本都严重下调。这构成了NPAS4L作为内皮谱系的主调节器。成血管细胞的初始迁移主要涉及hey2，Notch信号阳性的动脉前体细胞，3小时后有静脉前体细胞。这种迁移需要etv2，MO被敲除，导致成血管细胞中线迁移减少。成血管细胞的两个亚群都聚集在脊索的腹侧，并分别分化为背主动脉（DA）和相邻的基后静脉（PCV）。额外的EC贡献来自体节；然而，内膜对血管系统贡献的精确时间和性质需要进一步研究。与其他脊椎动物VEGFA信号转导的活性相一致，长期以来，人们认为体细胞来源的Vegfa蛋白可能在引导早期成血管细胞方面发挥重要作用。在缺乏KDR和KDRL的情况下，血管生成缺陷的缺乏并不支持这一概念。此外，不能产生Vegfaa-121和-165蛋白异构体的vegfaa突变体发展成一条流明的轴向血管，表明在缺乏Vegfaa蛋白的情况下，成血管细胞的迁移没有完全受到抑制。研究发现，在脊索细胞中表达于12hpf的短激素肽Elabela(Ela)是诱导成血管细胞迁移的中线引诱剂，其表达副作用的Ela受体Aplnra和Aplnrb。ela的胚胎突变或aplnra和aplnrb的双突变显示成血管细胞向中线的迁移严重受损。过表达研究表明ELA肽足以诱导血管母细胞迁移。一旦成血管细胞在中线聚集，相应的动脉和静脉亚群在22体细胞阶段形成单索，在此阶段报告EC从动脉到静脉索的持续混合。Hedgehog、Notch和Vegf通路在动脉分化中起着不可或缺的作用，其中突变体的动脉和静脉基因表达异常。多余作用转录因子Sox7和Sox18的缺失导致DA和PCV分离过程中的缺陷。这种形态发生缺陷伴随推测的动脉细胞中早期(24hpf)静脉标记物的异位表达，但是这是否代表原发或继发性缺陷尚不清楚。在26hpf左右，需要形成EC-细胞连接，并且必须发生小管形成以允许血液流动。EGF样结构域，egfl7在胚胎中线显示正常数量的EC的同时，在轴血管腔形成中起着关键作用。在scl/tal1突变胚胎中可以观察到类似的表型，成血管细胞迁移不受影响，但中线结构未能形成。体外数据表明，EGFL7可能是允许血管母细胞保持运动性的。在斑马鱼主轴血管形成后，侧枝的血管生成起始于DA，起始于22hpf斑马鱼。每个血管新生芽由多个内皮细胞组成，顶端的突起细胞从主动脉中流出，由丝状伪足引导，在垂直体节边界之间迁移。顶端细胞之后是茎细胞，向背侧迁移，最后形成背侧纵向吻合血管。DLAV由相邻芽的引导细胞形成。在此期间，血管变为管腔并建立血流。在斑马鱼中，正向遗传筛选已经成功地发现了许多血管发育调节因子。血管生成的关键分子调控因子包括Vegf信号通路，它对于血管发育是必不可少的。kdrl基因突变导致脑段间血管(ISV)萌发减少和躯干血管结构模式错误。这与研究证明VEGFA的关键作用是一致的。Kdrl与斑马鱼Vegfr2同源物Kdr共同作用来指导血管生成。plcγ突变导致动脉血管生成完全阻滞，细胞内plcγ在Vegfr信号转导下游起作用。最近的研究表明，Erk也是斑马鱼Vegfr信号转导中不可缺少的功能性细胞内激酶。有趣的是，在TMEM2突变体中VEGF/VEGFR依赖的ERK信号减少。Tmem2编码具有透明质酸酶活性的跨膜蛋白，控制透明质酸（HA）的周转，这对于血管生成是必不可少的，然而HA如何控制Vegf/Vegfr信号转导还需要进一步研究。许多其他的候选的Vegfr信号调节因子也被研究过，相关基因包括共受体Nrp1、Flt4(斑马鱼Vegfr3)、Rspo1等。激活Notch途径拮抗血管生成因子介导的ECs信号传导，Notch途径和Vegf途径之间的平衡动态地控制着血管生成侧枝的行为。

 

脑血管新生与血管完整性：在发育过程中，大脑的血管系统以复杂的方式形成，并且建立功能性的血脑屏障对于以后的组织内稳态是必不可少的。斑马鱼中枢神经系统发育过程中的主要血管是后脑原始通道(PHBC)、背外侧主动脉(LDA)和中枢动脉(CtAs)。LDA和PHBC的形成需要Vegf和趋化因子信号通路。

 

继发性血管生成与淋巴管生成：继发性血管生成涉及从32 HPF引起的PCV静脉内皮细胞的萌生。血管生成芽在背部出现，并与相邻的段间动脉(aISV)吻合形成段间静脉(vISVs)，或者进一步向背部迁移到躯干的水平肌间隔(HM)。VISV的形成决定了躯干的AISV和VISV构图的总体序列。前四个和最后一个ISV的性质基本上是恒定的，但是所有其他ISV的模式是随机的：如果前部血管形成aISV，那么下一个血管形成vISV的概率很高。在躯干的后部，血管新生的萌发也发生在尾静脉（CV）的过程，以不同的方式调节前干继发侧枝。CV在腹侧和背侧萌发，BMP信号驱动腹内萌发新生血管。

 

管腔化、吻合与血管重建：在鱼类中，第一个变为管腔的血管是DA，PCV紧随其后。DA起源于腹主动脉至脊髓索的脐带。这些ECs需要在它们的顶端形成紧密连接，形成管腔。这种“绳索中空”过程的关键是膜相关支架蛋白血管动素（Amot）家族的成员。Amotl2a和2b将VE-钙粘素/Cat.复合物连接到肌动蛋白丝，从而允许相邻细胞之间的力传递。敲除amotl2a/2b或用抑制肌动球蛋白的药物blebbistatin治疗导致DA内EC短而厚，并且不能形成管腔。相反，VE-cadherin突变体显示血管塌陷、变薄，但也不能形成功能性内腔。斑马鱼胚胎中还有一个大血管，在血流开始前就开始形成，即共同基静脉（CCV）。“腔内重生”的过程中，卵黄合胞层（YSL）和表皮之间已经存在的空间允许血液从前CV内的出口点流向心脏的心房。在YSL上形成静脉衍生EC的初始层，并且来自该层的单个EC以VE-cadherin依赖但与流动无关的方式分层，沿血流方向迁移，并最终合并以完全排列CCV。DA、PCV和CCV是大血管，它们形成的重要方面发生在血流开始之前且独立于血流。对于较小的ISV来说，情况是不同的，因为它们与血液灌注同时形成或随后形成。因此，在许多模型中，流动被认为是管腔形成的驱动器。对ISV内柄细胞的初步研究表明细胞内囊泡融合和“细胞空洞”，随后融合相互连接的腔隙。

 

斑马鱼血管发育的代谢调控：通过使用突变体，开始认识到代谢途径可以强烈和选择性地影响EC行为，并且可以作为血管生成治疗靶点的切入点。一个血管生成突变体定位到Cds2位点，它编码磷酸肌醇再循环和磷酸肌醇4，5二磷酸（PIP2）周转所必需的CDP-DAG合成酶。磷脂酰肌醇3激酶在细胞内信号转导中发挥作用，在血管生成中，磷脂酰肌醇3激酶利用PIP2在Akt上游产生PI(3，4，5)P3，而Plcγ水解PIP2，在Erk上游产生肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油。通过平衡PIP2的代谢代谢，CDS2通过ERK调节VEGF诱导的信号转导。另一个控制血管生成萌芽的代谢途径是糖酵解途径。果糖-2，6-二磷酸(F2，6P2)是糖酵解的强启动子，由磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB)的活性产生。PFKFB3在ECs中高度表达，与其他细胞类型相比，ECs具有较高的糖酵解活性。过表达PFKFB3的斑马鱼EC具有形成顶端细胞的倾向，这表明PFKFB3使EC更具血管生成性。. 此外，当通过过表达Notch胞内结构域来减少顶端细胞的形成时，PFKFB3的共同过表达可以挽救斑马鱼内皮细胞形成顶端细胞的能力。

 

结论：在这篇综述中，我们强调了斑马鱼血管生物学二十多年来的许多主要发现和关键步骤。我们关注的是细胞生物学以及血管如何发育的发育遗传学，而不是它们的功能。血管系统的发展是一个复杂和协调的过程。斑马鱼现在是研究血管发育的标准模型，也是研究血管疾病和血管药物发现的新兴模型。正如上面所强调的，发育遗传学已经产生了许多机制上的见解，这些见解使我们对哺乳动物血管发育的理解成为可能。斑马鱼的视觉可及性是斑马鱼的一种特殊性，我们已使用转基因系来可视化血管亚型、信号传导和蛋白质定位。我们已经从斑马鱼的研究中学到了关于血管系统如何发展的大量知识，并且已经开发了一系列疾病模型。展望未来，随着体内细胞生物学分辨率的不断提高，加上斑马鱼在遗传学和基因组学中的应用，这一领域的研究必将加速。这个模型将继续提高我们对新血管形成和功能的理解，并引导我们更深入地了解血管疾病中的问题。