摘要：纤维状胶原是许多组织的主要成分，但是由于与建立能够聚合成功能性原纤维的细胞和生物体相关的问题，使用转基因方法很难在体内成像。在此，我们发展并鉴定了基础表皮特异表达的GFP和mCherryⅠ型胶原融合斑马鱼系。我们用这些株系来揭示在发育中的胚胎表皮下胶原-I原纤维沉积的动态特性，以及创伤后该胶原网的修复。透射电镜研究表明，这些转基因株系忠实地复制了存在于野生型幼鱼皮肤中的胶原超微结构。在皮肤发育过程中，我们发现，胶原I最初由基底表皮细胞沉积在细丝中，细丝基本上是随机取向的，但随后在胚胎第4天时排列成交叉孵化、正交的亚上皮网络。在皮肤创伤之后，我们看到，表皮下胶原在被剥落的区域重新建立，最初是随机定向的纤丝，随后与未受损的胶原结合，并以重现表皮下胶原的发育性沉积的方式排列。通过GFP-胶原系与带有tdTomato标记的基础表皮细胞膜的GFP-胶原系杂交，显示出与愈合的表皮下胶原的重新沉积相比，伤口再上皮化的发生要快得多。通过使用其他组织特异性驱动物，能够建立斑马鱼系，以便能够对胶原沉积及其在健康和疾病中的各种其他器官中的重塑进行实时成像。

 

 

简介：I型胶原是皮肤上皮下真皮层中的主要细胞外基质（ECM）成分，它提供结构支持并作为细胞粘附和迁移的基质，作为几个信令级联的激活器。当皮肤受损时，修复过程中的关键步骤之一是沉积ECM，特别是I型胶原，以形成肉芽组织，其作为受损真皮和真皮下组织的临时替代物。在哺乳动物成年皮肤修复中异常的胶原沉积导致瘢痕形成，这对随后的组织功能可能是削弱的。相比之下，斑马鱼皮肤的创伤导致胶原“疤痕”的沉积，随后该胶原“疤痕”被消除，这可能提供一个理想的模型以确定创伤部位的胶原沉积如何被调节以防止纤维化和瘢痕形成。在此，我们报告一种表达荧光胶原的斑马鱼系，它能够组装成原纤维，并且提供机会来可视化体内胶原沉积的动态。先前在小鼠和鸡身上进行的电子显微镜研究揭示了I型胶原沉积的一些细胞机制，以及胚胎肌腱发育过程中原纤维排列的情况，其中原纤维排列在同一条轴上，但对于胶原沉积的更多研究则知之甚少。当皮肤正在发育或真皮组织在受伤后重建时，这主要是由于在模型生物体中实时成像这些过程的技术困难。已经使用了几种方法来可视化固定组织内的胶原，包括经典的组织染色如马松三色或胶原免疫组织化学染色。透射电镜为胶原沉积的超微结构分析提供了补充的机会。最近，利用多光子显微镜和荧光标记的胶原结合分子间接显示胶原的二次谐波(SHG)成像已经开始使胶原的实时成像成为可能。例如，已经用SHG跟踪活体组织中的胶原动力学，以研究小鼠肿瘤中的癌细胞/微环境相互作用。使用胶原模拟肽（CMPs）可以类似地检测小鼠肿瘤周围的胶原。虽然这些方法提供了间接的机会来成像组织中的胶原，但人们期望通过实时观察胶原沉积和纤维生成来获得更多的见解，在体内模型生物表达荧光标记胶原蛋白。我们选择斑马鱼作为模型系统，以探讨胶原蛋白的动力学，因为它的遗传可塑性和皮肤发育的光学清晰度。通过产生表达与GFP(或mCherry)融合的I型胶原的转基因斑马鱼系，我们可以在皮肤发育期间开始胶原蛋白的实时图像沉积，并且在修复皮肤时也跟随胶原蛋白的沉积。通过将这种转基因鱼与各种现存的转基因鱼类系杂交，我们可以例如在修复位点上探测表皮细胞和I型胶原沉积之间的相互作用。

 

结果：斑马鱼胶原蛋白Ⅰ-GFP标记：为了活体观察斑马鱼幼鱼皮肤中胶原蛋白的沉积，我们构建了表皮特异性GFP-胶原I转基因斑马鱼系。先前推测，由于复杂的纤维生成过程，用荧光蛋白标记胶原将具有挑战性，因为需要避免干扰四元结构和聚合能力，从而破坏随后的功能。我们仔细考虑GFP插入胶原分子的位置，以确保GFP标签保持附着，但不会显著干扰胶原聚合和组织内功能性原纤维的生成。斑马鱼Ⅰ型胶原由α1a、α1b和α2蛋白单体链组成，通常形成α1a(I)α1b(I)α2(I)异三聚体。对于哺乳动物I型胶原，斑马鱼a1(I)胶原的N-肽含有Willebrand因子C型(vWFC)的类似结构域，而a2(I)缺乏该结构域。我们不想干扰vWFC类似域可能赋予的任何潜在功能，因此我们选择了α2(I)链用于GFP标记。对人、小鼠和斑马鱼α2肽链的N-末端区域进行比对，以便能够识别结构域边界。这三种鱼类的22个氨基酸信号序列具有高度同源性（小鼠和斑马鱼86%）。N-末端蛋白酶位点负责指导前肽和末端肽从主要的三螺旋区裂解，该三螺旋区用于三聚体的形成。在所有物种中，N-末端蛋白酶裂解位点的侧翼序列是GNFAA|QY（用|表示裂解键）。我们通过靶向诱变去除了这个位点，以确保我们插入到这个位置的上游的GFP的保留。考虑到α2(I)的初级结构，我们在22个氨基酸信号序列的下游和N端蛋白酶切割位点的上游插入GFP，去除这两个位置之间的序列。将GFP-胶原Iα2表达为除野生型未标记胶原Iα2之外的转基因插入物，使得能够产生包含未标记和标记三聚体的嵌合胶原I原纤维，从而限制原纤维上存在的GFP分子的数量。

 

斑马鱼皮肤胶原Ⅰα2 GFP融合基因的构建：将GFP基因插入斑马鱼Ⅰ型胶原α2cDNA中选定的位置，产生col1a2-GFP。为了能够正确折叠胶原蛋白和GFP，在GFP的两端引入柔性甘氨酸-丝氨酸连接物。斑马鱼胶原I–GFP融合蛋白的功能首先通过驱动表达，使用CMV启动子，在小鼠成纤维细胞体外测试。这些细胞的荧光成像确实显示了GFP标记的纤维状胶原。通过使用krtt1c19e启动子(krt19)驱动col1a2-GFP的表达，建立表达结构。Krt19驱动基础表皮细胞层的表达，而基础表皮细胞层是先前报道的在斑马鱼发育的早期阶段负责皮肤胶原I沉积的细胞。鱼均表现健康多产，空间表达相似，但幼鱼间GFP强度不同。色素沉着减少的斑马鱼被用于辅助活体成像，特别是因为黑色素细胞迁移到伤口，并干扰荧光和SHG成像。随后对F1和F2代幼虫在4dpf时进行GFP表达的筛选，选择在幼虫皮肤内显示健壮、明亮和稳定的GFP标记I型胶原纤维的转基因鱼系。遵循类似的克隆和选择策略来生成互补的mCherry I型胶原蛋白。使用qPCR分析5dpf的基因表达表明我们最亮的鱼中的GFP标记大约为36％。

 

幼斑马鱼皮肤内Ⅰ型胶原形成规则的正交结构：GFP-胶原在Tg(krt19:col1a2-GFP)幼虫皮肤中的在2dpf时首先显现弱表达，到5dpf时强度增加，在头部背部首先观察到特别亮的GFP表达。在2dpf时，偶尔可见表皮细胞内的GFP-胶原，并且这些细胞附近的细胞外纤丝也明显可见。已有的基因表达研究表明内源性col1a2 mRNA在15体细胞期表达。4 dPF，纤维的正交性是完全明显的。绿色荧光蛋白标记没有扩展到鳍内幼虫转基因鱼。我们相信GFP荧光能反映基底表皮衍生胶原的位置，然而，Tg(krt19:col1a2)-GFP中的某些标记可能是异位的，因为使用了强非胶原I，角蛋白启动子。我们的Tg(krt19:col1a2-GFP)鱼的TEM研究证实在5dpf幼鱼皮肤内的正交原纤维在胶合板样层中定向，如先前对野生型鱼类所证明的那样，提示GFP标签（以及N-末端前肽和末端肽的去除）不会显著改变原纤维图案。

 

在皮肤受伤后，最初I型胶原蛋白沉积不规则，但随后被重新塑造成与未包裹的皮肤相同的正交模式。为了研究皮肤创伤修复中胶原沉积的动态，我们用皮下注射针，对4dpf的GFP-胶原幼鱼刺伤，观察了伤后不同时间点的GFP-胶原沉积情况。立即创伤后共聚焦显微镜检查证实在创伤部位的表皮下胶原I完全缺失。的确，先前关于小鼠胚胎伤口愈合的TEM研究揭示了创伤后ECM类似的“弹性”收缩。而I型胶原的“缺损”在损伤后3天内一直没有胶原，有清晰的边缘描绘了伤口的位置。我们观察到在表皮伤口快速闭合后，新的GFP-胶原I从4dpi开始沉积在伤口间隙中。这种新的胶原蛋白比相邻的未包裹的皮肤胶原的正交结构更纤细，排列更随机。在4-7dpi之间，伤口区域不规则胶原的数量增加，尽管，最近沉积的伤口胶原和伤口周围剩余的胶原胶合板结构之间仍然有清晰的界面。在这个界面上，我们看到了细小的连接物，表明新的胶原可以沉积/融合到现有的原纤维上，从而将修复基质延伸到伤口区域。9～11dpi时，创面内的表皮下胶原I与周围未结合的基质结合更紧密，部分区域向创前正交方向发展。到16dpi，伤口部位越来越难定位，因为对于许多鱼类来说，伤口部位的胶原蛋白已经完全分解回到接近完美的伤口前正交模式，没有留下表皮下网状结构缺陷的痕迹。