广东省实验动物信息网

编者：1988年《实验动物管理条例》发布实施，在实验动物工作规范化、法制化管理，保障实验动物和动物实验的质量，推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模型创制方面，取得了令人瞩目的成果。

资源增量是实验动物科技发展的核心任务，是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80年代以来，我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣，在实验动物资源研发工作中取得的多项开创新成果。在“十三五”国家重点研发计划课题（2017YFD0501606）和中央引导地方科技发展专项项目课题的支持下，以景志忠教授为首的研究团队在实验用合作小型猪培育与抗病免疫分子遗传特性研究与应用方面开展的深入研究。

为此，借“科技资讯”之窗，介绍该项目所取得的成果。

实验用合作小型猪培育与抗病免疫分子遗传特性研究应用现状

景志忠 陈国华 贾怀杰 房永祥 何小兵

中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室

合作猪，又称蕨麻猪（因采食蕨麻而得名），也称藏猪或山猪，是甘肃、青海、四川、云南、西藏等藏族地区饲养的一种小型原始地方猪品种。合作猪主要分布在甘肃省西南部、青藏高原的东部边缘，中心产区在甘南藏族自治州的合作市以及周边的夏河、碌曲、卓尼等县，因而1984年被定名为合作猪[1]。

一、合作猪的基本特性与利用优势

（一）品种形成环境与特点

由于长期生存在恶劣高寒气候(海拔3000 m左右，最低气温-28℃,最高气温27.7℃，年平均温度 1-7 ℃，温差较大)和低劣的饲养条件下(终年以放牧为主，采食蕨麻等牧草的根、茎、籽及农作物的秸秆等), 具有许多适应高原环境的特点,即具有良好利用野生植物的能力，体质结实、四肢健壮、性野、行动敏捷、鬃长和绒毛密生等特点。其次，由于地处偏僻山村，交通不便,长期自繁自养封闭繁殖，未受外来血缘的影响, 形成了一个遗传相对稳定、均一的原始地方猪种。其三，合作猪体型小、生长缓慢,在畜牧业生产中使用价值不大。据不完全统计，甘南州“合作猪”的数量仅有6万多头 ，而且大部分地区的合作猪已被杂交，猪种血缘混乱，致使这一珍贵种质资源濒临灭绝，亟待保护[2,3,4]。近年来，随着合作猪生物学价值和食用价值被重新认识，合作猪优秀的抗逆性和肉质特征以及适于实验动物化培育的优势，成为未来发展的趋势。

（二）品种基本特征

合作猪体型较小，性情野，行为机灵活泼[2,3,4]。合作猪毛色纯黑的少，一般四肢、腹部、背部等部位为白色，被毛粗密而长，冬生棕色绒毛，鬃长且坚韧。初生仔猪背部毛色带有棕黄色或褐色纵行条纹（松鼠背色），随日龄增长而逐渐消失。合作猪头窄长，呈锥形，嘴长而尖，犬齿发达，耳小向上直立，额无明显皱纹，颈和体躯较短，胸较狭窄，背腰平直或微弓，后躯较前躯略高，臀窄而倾斜，四肢长短适中，健壮，跟系短而有力，蹄小坚实；乳头 4-6 对，排列整齐。成年公猪体重约33.31kg，母猪约34.84 kg。母猪 4-5月龄开始配种，产仔数较少（平均3.6头），繁殖率较低。合作猪日增重较低，约210.01 g/d，料肉比偏高达3.51。

（三）实验动物化前景

合作猪体型小，易于进行微生物控制, 可培育成国际上最小的实验用小型猪。合作猪品种纯，遗传稳定。由于合作猪分布在偏僻的高原地带, 很少受外来血缘的影响, 同时在畜牧业生产中, 因其体型小、繁殖性能较低, 一般未能进行杂交改良用于畜牧业生产, 保存了原始的均一的矮小基因库，且其遗传背景比较清楚。合作猪适应能力强,可望培育出国内外独特的高原型小型猪新品系。目前培育成功的贵州小型猪、版纳小型猪、巴马小型猪和五指山小型猪，其均来源于生长在海拔较低, 温度、湿度较高的地区，而合作猪则生长在截然不同的自然环境，这是长期自然选择的结果，其适应性强可能有其必然性。然而，合作猪繁殖性能低，野性大，毛色杂，不利于实验动物化培育。

合作猪体型小、品种纯、适应能力强，若能将其进行实验动物化和小型化定向培育,使之保持体型小、抗病性强，而同时具有其它品种的优良的繁殖性能, 并符合实验动物科学的需要,即遗传的均一性、实验的重复性和微生物的控制性等,可望培育成国际上更为理想的实验用小型猪品系，满足生命科学研究、生产及其产品质量检验，具有广阔的应用前景和优势[2,3,4]。

二、合作小型猪的培育与遗传稳定性分析

2003年中国农业科学院兰州兽医研究所从夏河县等地引进2头3-4月龄的一公一母仔猪（兄妹）和一母猪带仔5头（母猪约1-2岁，为全黑色；仔猪约20日龄左右，1头为松鼠背，其余4头为黑色或六端白），在兰州进行异地适应性饲养和观察。按照“合作猪实验动物化培育、近交系培育和SPF化培育”的三阶段总体设想和战略布局，在甘肃省科技计划项目的支持下，兰州兽医研究所先后开展了“中国合作小型猪实验动物化培育及分子遗传特性研究”（1004TCYA001）和“近交系合作小型猪的培育及其分子遗传特性研究”（1207TCYA025），重点对其生活习性、生长发育、繁殖性能和抗病性进行观察，同时采用现代分子生物学、分子遗传学和分子免疫学技术对控制其生长发育和抗病相关的关键分子进行分子遗传特征研究，并对培育的合作小型猪进行免疫学基础研究应用。

（一）合作小型猪的培育

1.合作猪的驯化与适应性培育

在原产地甘南藏族自治州夏河县引进合作猪的基础上，依据实验动物学质量控制要求，按照合作猪驯化、饲养和日常管理规范（草案），在异地环境（海拔1500m,温度15～28℃）兰州市进行适应性舍饲饲养，每天2次配合饲料自由采食，全天自由饮水，追踪性观察和测定其生活习性、采食饮水、外貌特征、生长发育、生产性能以及生理生化指标变化。试验发现，合作猪在饲养和培育到F6～7代时其野性逐渐消失，吻突变短，绒毛减少，体型钝圆，毛色光亮，未出现因营养、环境优越而产生体重、体型明显增大的现象（未发表资料）。

2.近交系合作小型猪的培育

按照近交系实验动物遗传控制标准（甘肃省质量技术监督局2018-T-106立项制定），采用“兄妹”或“父女”交配的方式进行繁殖，追踪观察和测定其外貌特征、生长发育、生产性能以及繁殖性能指标。经封闭近交定向培育，已近交培育到F13～14代，其遗传性状日趋稳定，初步建立了全黑、六端白、松鼠背和大黑白花合作小型猪4个近交家系的种群繁殖单元，总种群达50头以上。同时，已制定并经甘肃省质量技术监督局发布实施了“实验用合作小型猪繁育技术规程”（DB62/T 2897-2018）地方标准1项，以指导近交系合作小型猪的扩群繁殖与生产[5]。

3.封闭群合作小型猪培育

在建立近交系合作小型猪种群繁殖单元的基础上，按照封闭群遗传标准和要求，重点建立全黑、六端白、松鼠背3个封闭群单元作为繁殖扩大群，种群达60头左右，生产提供实验用合作小型猪800余头，用于生长发育分子遗传特性、免疫抗病特性以及疫苗质量评价研究应用，探讨作为实验动物的可行性。试验应用发现，培育和生产的合作小型猪与商品猪相比具有遗传背景和微生物携带情况清楚、基因纯等特点，试验结果均一、重复性好，适合作为感染、免疫机制以及疫苗质量评价的靶动物模型（未发表资料）。

由于目前猪病复杂多样，为了防止合作小型猪被自然感染以及培育SPF或非免疫近交系小型猪的需要，按照合作小型猪的遗传和微生物质量控制标准（甘肃省质量技术监督局2018-T-106和2018-T-107立项制定），在兰州和静宁两地同时进行保种、培育和扩大生产，且通常情况下不接种任何疫苗，这为后期SPF级小型猪的培育奠定了基础。

（二）合作小型猪生长发育遗传稳定性分析

为探讨遗传、营养和环境对合作小型猪生长发育控制的影响，重点分析其染色体核型以及生长激素基因的分子组成结构和多态性，已证实合作小型猪遗传多态性丰富、生长发育遗传稳定、体型小的特性，主要由遗传基因控制而非营养、气候环境因素决定。

1.染色体核型分析

随机无菌采集近交系合作小型猪（公、母各半）抗凝血，37℃恒温培养68-72h，在终止培养前2-3h加入秋水仙素溶液使细胞分裂停止在中期，在显微镜下观察细胞染色体的形状、数目和核型。证实合作小型猪体细胞染色体为2n=38（母猪为XX，公猪为XY，性染色体以X、Y表示），其中常染色体18对，性染色体1对，以其他猪种相同（未发表资料）。根据染色体的相对长度、着丝点指数和臂比，将18对常染色体分为A、B、C、D 四个形态组，分别标以1～18号组成合作小型猪的染色体核型。其中A组：由1～5号5对染色体组成, 属于近中着丝点染色体（sm）。B组：由6～7号2对染色体组成，属于近端着丝点染色体(st)。C组：由8～12号5对染色体组成，属于中着丝点染色体(m)。D组：由13～18号6对染色体组成，属于末端着丝点染色体(t)。性染色体：X染色体和Y染色体均属中着丝点染色体，X染色体的大小介于8号和9号染色体之间，Y染色体为最小的中着丝点染色体，较易辨别。

2.生长发育控制关键分子遗传特征研究

生长激素是控制动物生长发育的关键分子，故以其生长激素基因为对象，在基因组和转录水平探讨其分子结构、多态性以及遗传特征。

（1）合作小型猪生长激素功能基因与基因组结构分析

从合作小型猪血液中提取基因组DNA，用生长激素基因参考序列设计引物，可扩增出1671bp的合作小型猪生长激素基因组序列。该基因组全长序列包含5个外显子和4个内含子，其中外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201 bp，内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277 bp，外显子和内含子之间的剪切序列符合GT-AG规则；合作小型猪生长激素功能基因全长651bp，推测编码216个氨基酸的前体蛋白，成熟蛋白是一个由190个氨基酸残基组成的分泌性蛋白。与参考序列比对，外显子中取代和缺失的碱基数合计为4bp，内含子中取代和缺失的碱基数合计为15bp，这说明内含子的序列多态性大于外显子[6,7]。

（2）合作小型猪生长激素基因序列多态性分析

为探讨合作小型猪的遗传多态性，选择GenBank中14条猪生长激素基因序列作为参考序列，与合作小型猪的5条生长激素基因序列比较，其多态性主要表现在内含子1有1个转换和1个颠换，内含子2有2个转换，说明合作小型猪间的差异可能与其内含子的关系更密切。合作小型猪与其他14 种猪之间在编码区和非编码区共检测到核苷酸变异155个，其中内含子中有119个，外显子中有28个。在所有的核苷酸变异中，其中颠换有104个，转换有14个，缺失有23个，插入有14个。在出现的碱基取代位点中，大多数是颠换型突变，颠换与转换之比为7.43∶1，存在颠换偏移现象。对合作小型猪生长激素基因同源性和趋异性分析发现，合作小型猪与国内其它小型猪同源性较近，与大型猪同源性较远。15种猪生长激素基因遗传演化分析表明，合作小型猪与Vize 猪有较远的亲缘关系，与贵州榕江香猪亲缘关系最近[8,9]。

（3）合作小型猪与其它猪种群间的遗传演化关系分析

用9个微卫星DNA座位对5个猪群体（合作小型猪以及兰州、武威、临洮和青海四个杂种猪群）的125个个体的平均等位基因频率、遗传距离DA、标准遗传距离Ds，主成分PC1、PC2、PC3值进行遗传检测。结果5个猪群体共检测到148个等位基因，每个群体等位基因数的范围在55～100个之间，其中青海猪群中最多为100个，合作小型猪群体中最少为55个，说明青海猪群体的多态性高，而合作小型猪群多态性小。其次，合作小型猪群体与兰州白杂猪群体不但遗传距离值最大(DA=0.6781)，而且标准遗传距离DS值仍最大，达到1.3312。主成分分析显示，PC1、PC2和PC3分别占比为62.17%、16.89%和10.94%，其中第一主成分PC1与合作小型猪有较大的正相关，与其它的呈较大的负相关，它能代表合作小型猪； 第二主成分PC2与兰州白杂猪有较大的正相关，与其它的呈负相关，它能代表兰州白杂猪群体；临洮、青海和武威等三个杂种猪群体在PC1-PC2坐标中具有较近的距离，表明临洮、青海和武威这三个杂种猪群体有相似的主成分。这说明合作小型猪群体在遗传上远离兰州白杂猪群体，更远于临洮、青海和武威三个杂种猪群体[8,9]。

三、合作小型猪在抗病免疫分子遗传特征研究中的应用

机体对病原微生物感染的防御是由天然免疫系统和获得性免疫系统介导的，其中天然免疫在机体的非特异性抗感染免疫过程中发挥着至关重要的作用，是机体抵御病原感染的第一道防线。获得性免疫由T细胞和B细胞介导的针对病原成分而启动的特异性细胞免疫和体液免疫应答，发挥着命运决定者的作用。利用已培育的合作小型猪对其抗病免疫关键分子：主要组织相容性复合物（MHC）（或猪白细胞抗原SLAⅠ类和Ⅱ类分子）、T细胞抗原受体（TCRs）以及模式识别受体（PRRs）和细胞因子家族分子基因进行系统研究，探讨其基因结构组成、多样性与抗病分子遗传特征，为免疫抗病基础研究提供理想的动物模型。

（一）合作小型猪天然免疫效应分子-细胞因子研究

机体免疫系统的应答程度决定了其能否阻挡病原的感染，并阻碍感染的进一步发展，而其效应机制主要是通过高活性多功能的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白等细胞因子来实现，大多数的细胞因子以旁分泌、自分泌或内分泌的形式发挥其生物学效应。目前按其主要生物学功能分为白介素(IL)、干扰素（IFN）、集落刺激因子(CSF)等六大类。合作猪是适应性和抗逆性较强的猪种，由于细胞因子是免疫抗病的主要效应分子，因此从其抗病免疫相关的细胞因子研究入手探讨合作小型猪与抗病的关系。

首先，建立了刺激诱导转录RT-PCR扩增法和cDNA表达文库法克隆、发现抗病免疫相关细胞因子基因的技术，为高通量筛选和发现未知细胞因子或其它相关分子奠定了基础[10]。其次，以合作小型猪为研究对象，采用诱导转录RT-PCR扩增法和cDNA基因文库法技术，先后克隆、表达和鉴定分析了猪白介素家族的IL-2、4、6、12、18基因[11-17]，猪干扰素家族的IFN-α/γ基因[18,19]，集落刺激因子基因[20]，CD58基因[21]以及CD4/CD8分子基因[22-24]等；建立了动物体内重组表达含细胞因子基因或组合的重组质粒免疫佐剂[25-26]，先后申报专利5项，授权3项，结合其他相关研究成果获得数项省部级科技奖励。

（二）合作小型猪天然免疫识别分子-PPRs研究

由于模式识别受体是近20年来才发现和定义的与机体天然免疫最重要的、最直接的相关分子，目前已先后发现了TOLL样受体（TLRs）、RIG-I样受体（RLRs）、NOD样受体（NLRs）、AIM2样受体（ALRs）、C型凝集素受体（CLRs）、胞质DNA识别受体家族如cGAS（cGAMP synthase）等，其中TLRs是在小鼠和人类上最早发现并研究得比较深入的家族，故在合作小型猪模式识别受体研究中以其为重点，探讨其与抗病的相关性。

首先，建立了用基因组学和生物信息学方法克隆、鉴定TLRs家族基因的技术，成功先后克隆、表达和分析了猪TLR2[27,28]、TLR3[29]、TLR7/TLR8[30,31]以及接头分子MyD88基因[33]等，明确了其分子遗传演化关系，揭示了其与天然免疫的关系；同时克隆、表达和分析了猪cGAS、RIG-I、DHX15、DHX16等受体的分子结构特征与模式识别抗病毒作用（未发表资料），为模式识别天然免疫分子机制研究以及免疫佐剂、抗病毒药物的研发奠定了基础。

（三）合作小型猪获得性免疫相关分子-MHC研究

动物机体识别自我、排除非己成分以维持其正常生理活动和抵抗疾病的能力，与其主要组织相容性复合体( MHC)密切相关，其不仅控制着机体移植排斥反应，还参与机体对内/外源性抗原的识别、结合，与机体获得性免疫应答有关。MHC分子在人类称为HLA，在猪称为SLA (Swine lymphocyte antigen)。其中经典的SLAⅠ类和SLAⅡ类是其免疫相关的最重要的分子家族[34]。以合作小型猪为研究对象，并与甘肃白猪和相关物种的SLA基因作比较，重点研究其SLAⅠ类和Ⅱ类分子的基因结构及其遗传多态性，为抗病基础研究提供依据。

在国内首次系统克隆和分析了猪MHCⅠ类/Ⅱ类分子中的SLA-1、SLA-2、SLA-3以及DRA/DRB、DQA/DQB的基因组13个（SLAⅠ类分子GenBank登录号为FJ905829～FJ905834，SLAⅡ类分子为FJ905835～FJ905840）和功能基因14个（SLAⅠ类分子GenBank登录号为FJ905817～FJ905822，SLAⅡ类分子为FJ905823～FJ905828），证实合作小型猪SLAⅠ类分子的基因组均由8个外显子和7个内含子组成；而SLAⅡ类分子α、β链的外显子和内含子组成有差异，其中DRA和DQA由4个外显子和3个内含子组成，DQB由5个外显子和4个内含子组成，DRB则由6个外显子和5个内含子组成，明确了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因组的组成结构[35,36]。

系统分析合作猪SLAⅠ类基因结构的多态性，发现SLAⅠ类分子基因可分为五个功能区，其多态性位点主要集中在α1与α2结构域，具有较多的单态性核苷酸位点（SNPs），其中核苷酸非同义置换位点数多于同义置换位点数。SLAⅠ类分子共有21个新的SNPs位点，其中SLA-1有4个，主要位于α2和α3功能区；SLA-2有6个，主要位于α1、α2和α3功能区；SLA-3有13个，主要位于α2和α3功能区。系统分析合作猪SLAⅡ类基因的结构及其多态性，发现SLAⅡ类分子基因在四个功能区的多态性位点主要集中在α1（β1）结构域。SLAⅡ类分子共有23个SNPs位点，其中DRA有5个，DQA有6个；DQB有4个，DRB有7个。这基本明确了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子功能基因的多态性和遗传特征，并针对这些遗传特点重点分析了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子与抗原多肽、TCR、CD4/CD8结合部位的结构与特征，揭示了合作小型猪SLA分子与抗原多肽、TCR以及CD4/CD8多分子识别结合的特异性和复杂性[37]。

揭示了猪瘟C株疫苗免疫诱导PBMC的SLA等位基因优势选用，可能与T细胞的克隆化存在一定的相关性[38]。在猪瘟C株疫苗免疫后，实验猪均表现出规律性的差异表达趋势。其中实验猪的SLAⅡ类基因（SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB）在第3天和第5天均表现为上调表达，其中第5天达到高峰约为免疫前的2-2.5倍，第9天开始回落；SLAⅠ类基因在第3天表现为上调表达，表达量约为免疫前1.5-2倍，第5天均回落；分别用SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB的特异性引物PCR 扩增其全长基因发现，基因扩增条带单一，与目标片段大小与预期结果一致。但进一步测序分析发现，实验免疫猪SLA-DRA和SLA-DRB中均存在一个高频表达的全长序列（等位基因亚型），说明猪瘟疫苗毒免疫后能促进机体SLA的表达，并产生抗猪瘟病毒免疫特异的反应，且与机体抗原递呈细胞（APC）经受抗原刺激而活化参与T细胞免疫应答的规律相类似，这为猪瘟新型表位肽疫苗研制提供了理论依据。

（四）合作小型猪获得性免疫相关分子-TCR研究

T细胞受体（αβTCR）在机体获得性细胞免疫中扮演着重要角色，但由于其基因的遗传多样性和结构复杂性，基于病毒感染或免疫特异的猪αβT细胞克隆化增殖研究在国际上尚属空白[39,40]。

以合作小型猪为研究对象，开展了猪TCR分子基因结构与复杂性研究, 系统克隆和分析了TCRα基因108个[41]、TCRβ基因98个[42]、TCRγ基因15个和TCRδ链基因5个，共计226个功能分子基因，初步建立了“健康”猪αβTCR和γδTCR T细胞TCR基因库。测序分析表明，猪α、β、γ、δ 4种TCR亚基链都含有信号肽区、V区、D/J区和C区基因片段，但其亚基链间以及同一亚基其基因序列组成都有所不同，这验证了T细胞激活后能产生胚系发育和基因重排现象，证实了TCR基因的胚系发育、基因重排规律与其分子结构多样性的相关性。

成功建立了猪CD8+、CD4+的T细胞亚群TCR CDR3区基因谱型分析技术，研究了临床健康猪TCRα、β链CDR3的谱型种类及多样性。发现20个TRAV家族和TRBV家族在大部分αβTCR家族中表达，且其CDR3的谱型呈现类高斯分布，大多数含有8种以上不同长度的CDR3片段；同时，同一个体中不同TRV家族CDR3的出现频次相差较大，即使同一TRV家族在不同个体中的出现频次也不完全相同。这些现象和规律与αβT细胞胚系发育、基因重排的分子机制和多样性特征相一致[43,44]。

首次分析了猪瘟C株疫苗毒感染特异的T细胞αβTCR表达规律及其结构特征，明确了免疫后猪CD4+和CD8+ T 细胞TCRα链和β链多样性与克隆化动态规律，搞清了二次免疫后呈现克隆性扩增的TRAV和TRBV家族CDR3序列结构特征，为猪瘟病毒抗原肽疫苗研制和病原抗原免疫机制研究提供了依据[45]。

对克隆化的αβTCR 家族CDR3区及全长基因测序和分析发现，αβTCR 家族CDR3区除有经典的分子结构特征外，其中TRBV CDR3区还有保守的 P-A-V氨基酸基序，TRAV CDR3区也存在保守的D-D-Y氨基酸基序,而且CDR区序列完全相同的基因表达频率较高，可达50％以上。其次，克隆化αβTCR 完全相同CDR3区的全长基因成员间的核苷酸序列相似度均在99%以上，这说明这些克隆化家族CDR3区的保守氨基酸基序可能与猪瘟病毒特异抗原肽的识别和结合有关，这为高通量筛选和开发猪瘟多肽疫苗提供了理论和技术依据[46]。

四、结论

成功异地近交培育了合作小型猪4个近交家系和3个封闭群，证实其体型小的特性，主要由遗传基因控制而非营养、气候环境因素决定。证实了合作小型猪群体内等位基因数目少、重复次数高和遗传稳定，与其它猪群体间的亲缘关系远，且没有杜洛克等西方猪血缘，是一群比较理想的独特的高原型近交群体。合作小型猪抗病免疫关键分子基因分析发现，其具有丰富的多态性和多样性，一方面说明合作猪具有长期适应各种恶劣的自然环境和复杂的病原微生物环境的抗病遗传能力，另一方面说明合作小型猪的这种遗传特性适合用于研究复杂的免疫学现象与机制。

参考文献详见：国家实验动物专家委员会简报 2019年第7期