一、固定时的注意事项

1.组成细胞的主要成分为蛋白质、脂类和糖类，根据研究目的不同分别选用不同的固定剂和固定方法。

2.固定液要足量，一般应为组织块总体积的4～5倍，应在组织取下后立即或尽快放入固定液中。对于有特殊要求组织(如神经染色及酶组织化学染色等)的固定，应特别注意。组织块的大小、固定时间、固定温度都应考虑。

3.组织块的大小、厚度可根据组织类型而不同，但组织要得到良好的固定，以3mm较为合适。

4.固定时间  大多数组织应固定24h，然后保存于70％乙醇中。有些组织固定的时间与使用固定液的种类、组织块大小、温度等有关。

5.固定温度  大多数可在室温(25℃)固定，在低温(如4℃)固定时，固定时间应相应延长。

6.加热可使蛋白质凝固，但一般不要求加热，因为加热可加速组织的自溶。

二、常用固定液

1. 10％甲醛  市售的为40％的甲醛水溶液，也称为福尔马林，需用pH7.2的磷酸盐缓冲液配成10％的固定剂，对蛋白质、高尔基体、线粒体等固定效果好，价格低，可用于固定和保存大标本。

2. Bouin液  是一种混合固定液，用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。尤其适用于固定含脂肪的淋巴结、乳腺组织等标本。

3. Zenker液  常用的混合固定液，可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色清晰，常用于三色染色。

4.中性缓冲甲醛液  为免疫组织化学最常用的固定液，对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好。固定时间以24h为宜。

5.中性甲醛液  是最常用的固定液之一，固定效果好。

三、病理标本的切片

1.组织的脱水、透明、浸蜡

组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。最常用的脱水剂有乙醇、丙酮等。为避免组织过度收缩，脱水时配成不同的浓度进行梯度脱水。

为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过既能与乙醇混合又能溶解石蜡的二甲苯、苯、甲苯等透明剂透明。

组织经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过2～3次石蜡浸渍才能完成。在具体应用时，还应考虑当时的情况，一般在夏天气温较高的情况下，应采用高熔点的硬蜡，而在气温较低的季节，应用低熔点的石蜡，这样有利于切片制作。组织块总的浸蜡时间约3～4h。当然也应根据组织块的种类和大小以及温度情况加以灵活掌握。时间不宜过长，否则易造成组织块脆硬，切片成豆渣样。时间不足，也难制作良好的切片。对不同厚度的组织块，相应时间也不同。

2.组织的包埋

组织经过浸透剂(石蜡、树脂等)浸透后，用包埋剂(石蜡、树脂等)包埋制成组织块，有利于切成薄片。不同的包埋剂包埋方法不同，以常规石蜡包埋为例简述如下：先将熔化的石蜡倒入包埋筐，而后用加温的镊子将浸蜡的组织块放入。包埋面必须平整，包埋温度不应过高，一般用56℃的石蜡。包埋完毕，蜡块稍凝后，可移入冷水加速凝固。

3.组织切片法

组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋切片法等。以最常用的石蜡切片法为例简述如下：

切片前首先检查切片刀是否锋利，有无缺口。准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置、大中号优质狼毫毛笔和铅笔(用于在载玻片的粗糙端写号)。

(1)预先修好的组织块先在冰箱中冷却，而后装在切片机固定装置上。将切片刀装在刀架上，刀刃与蜡块表面呈50°夹角。将蜡块固定，调整蜡块与刀至合适位置，并移动刀架或蜡块固定装置，使蜡块与刀刃接触。

(2)切片多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，但小标本注意不要修得太多，以免无法切出满意的用于诊断的切片，大标本应注意切全。切出蜡片后，用毛笔轻轻托起，而后用眼科镊夹起，正面向上放入展片箱，待切片展平后，即可进行分片和捞片。切片经30％的乙醇初展后，再用载玻片捞起放入展片箱展片更易展平。

(3)轮转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端。

(4)捞片时注意位置，要留出贴标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即写上编号。

(5)切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱内烤30min即可。血凝块和皮肤组织应及时烤片。但脑组织(人体较大组织)完全晾干后，才能进行烤片。否则，可能产生气泡影响染色。

4.切片的注意事项

(1)组织块的大小：厚薄应适当，过大、过厚的组织，固定液不易渗透，易引起固定不良。过小、过薄的组织，在固定和脱水的过程中易变硬或产生弯曲扭转，同样影响切片质量。

(2)组织脱水、透明和浸蜡：组织脱水用的各级乙醇，应保证相应浓度，以便组织脱水彻底。组织脱水、透明和浸蜡过度，组织块变硬变脆，因此对于小块组织或小动物标本应注意时间。但若时间不够，组织块硬化不够，也不利于切片和染色，为诊断带来困难。

(3)切片组织块固定不牢时，切片上常形成横皱纹。切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多因切片刀不锋利所致，切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。

(4)切片刀和切片机：切片刀放置的倾角过大切片上卷，不能连在一起；过小则切片皱起，一般倾角放置以20°～30°为好。

(5)特殊要求切片的制作：石蜡切片虽然有很多优点，但制片过程中要经过乙醇和二甲苯等有机溶剂处理，因此很易造成组织内抗原性的丧失，在用于免疫组织化学染色时影响结果的准确性。因而有人采用冷冻干燥包埋法，即将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空和低温条件下除去组织内的水分，然后用甲醛蒸气固定干燥后的组织，而后再进行浸蜡、包埋和切片。此法可保存组织内的可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，减少抗原的丢失。用于免疫荧光标记、免疫酶标记等。