摘要：巨噬细胞对纳米粒的识别受粒径和表面修饰的影响很大。由于缺乏合适的体内筛选模型，因此对纳米药物的这种非预期清除机制进行定性和优化仍然是一项挑战和耗时的工作。因此，我们验证斑马鱼胚胎作为一种新兴的脊椎动物筛选工具，在现实的生物条件下评估具有不同粒径的表面修饰颗粒制剂的巨噬细胞固存。以不同PEG密度（3.0-10.0 mol%）和粒径在60-120 nm之间的不同PEG分子量（PEG350-PEG5000）脂质体作为一个成熟的参考系统，显示巨噬细胞摄取的不同程度。体外实验、斑马鱼胚胎和啮齿动物体内生物分布研究的结果是一致的，强调了新引入的斑马鱼巨噬细胞清除模型的有效性。我们在此提出一种有效、系统和快速的纳米药物优化策略，以促进纳米疗法的临床前发展。

 

斑马鱼模型作为预测脂质体巨噬细胞清除率的筛选工具的验证。用不同PEG分子量和不同PEG密度修饰的脂质体验证斑马鱼作为脂质体巨噬细胞清除率的筛选模型。

 

 

简介：纳米药物通过向病变组织或器官输送感兴趣的药物，提供有价值的治疗选择。通过改变其物理化学性质，纳米药物与巨噬细胞和单核吞噬细胞系统（MPS）的其他细胞的相互作用可根据预期用途进行调整。一方面，这可以用来治疗各种疾病。例如，在炎症和癌症期间，纳米药物可以用来改变巨噬细胞的极化状态。此外，一些感染性病原体如肺结核持续存在于巨噬细胞中，因此针对这些微生物库可以显著降低疾病的进展。脂质体的大小差异可能对其药动学和清除率有重要影响。例如，为了避免肝螺旋体快速清除，建议的粒径上限为150 nm，而粒径下限则由肾小球滤过尺寸截止值约为6 nm设定，以避免肾脏清除。设计新型纳米药物的一个主要挑战是缺乏合适的筛选模型来优化纳米颗粒的理化性质。到目前为止，体外模型只能用于研究细胞与纳米颗粒的相互作用。无法通过体外实验预测物理化学性质和表面修饰的微小变化在多大程度上影响体内的纳米颗粒循环特性及其在脾等富含巨噬细胞的器官中的积聚。取代聚乙二醇的新型纳米药物成分，如各种各样的聚合物、聚天冬氨酸、超支化聚醚链或聚甘油衍生物，不断合成，需要进行彻底的分析。这种新型纳米药物制剂必须在体内进行测试，以解释活体动物的全部复杂性，包括血流、剪应力和血清蛋白的存在。斑马鱼胚胎已被提出作为脊椎动物纳米药物筛选模型。最近的研究表明，使用这种新的筛选工具，可以及时有效地评估纳米粒子的系统循环。由于适应性免疫系统的进化发生在鱼类与其他脊椎动物分化之前，因此斑马鱼和哺乳动物的固有和适应性免疫系统是高度保守的。受精后30小时，斑马鱼胚胎中存在早期胚胎巨噬细胞。此外，成年斑马鱼还可以发现其他的细胞，如单核细胞和树突状细胞，它们决定了哺乳动物的MPS。极化巨噬细胞（M1，M2）存在于斑马鱼胚胎中，对于治疗癌症或炎症疾病的纳米药物具有特殊的重要性。结论斑马鱼在生理条件下有可能通过巨噬细胞评估动物体内的纳米药物清除率。本研究的目的是验证斑马鱼模型用于研究巨噬细胞的纳米颗粒清除率。聚乙二醇脂质体被用作一个成熟的模型系统。在活体条件下，采用系统的斑马鱼筛选方法，评价了PEG分子量（PEG350-PEG5000）、PEG密度（3 mol%-10 mol%）和脂质体大小（60-120 nm）等参数对斑马鱼巨噬细胞清除率的影响。采用微流体实验设计（DOE）方法制备了具有生理相关性和明确尺寸范围以及不同PEG修饰的单分散脂质体制剂，并对其进行了理化和体外表征。用转基因斑马鱼胚胎结合荧光标记的脂质体制剂研究巨噬细胞清除脂质体的作用。

 

利用全因子实验设计（DOE）制备斑马鱼注射剂用荧光脂质体:如前所述，脂质体是用微流体制备的。人字形混合结构确保了两相的最佳混合，从而形成脂质体。. 为了控制脂质体的大小，改变了两个液相的流速比（frr，水相和有机相的比例），从而影响了极性变化的速度。为了最终确定每个脂质组成的最佳FRR，并分析PEG分子量和PEG密度对脂质体大小和PDI的影响，如前所述，对各种临床批准的脂质体配方使用全因子DOE。使用Stavex 5.2软件对统计数据进行分析和模型拟合。脂质溶解在乙醇中，而水相则由DPB组成。总流速（tfr）保持恒定在10 ml/min，同时针对每种配方调整溶剂和水物流之间的流速比（frr）。使用分子量为12-14 kda的透析膜, 将脂质体配方在水中透析过夜.

 

大鼠体内放射性标记脂质体的制备:如前所述，对脂质体使用111In进行放射性标记。在柠檬酸盐缓冲液ph 5.4中，在总脂质浓度为60 mM下制备不同大小的脂质体。脂质体注射前在37℃下用111InCl3 孵育45分钟，用凝胶过滤色谱纯化。将外缓冲液换成无菌盐水。

 

动态光散射测量：如前所述，使用Delsa纳米C粒子分析仪通过动态光散射（DLS）测定脂质体样品的尺寸和多分散指数（PDI）。所有测量均在室温下于10 mM脂质水溶液下进行。肝癌源性细胞系HepG2和SK-Hep1由瑞士巴塞尔大学医院病理学研究所的细胞库提供。细胞保存在含有10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的DMEM高葡萄糖（4.5g/L）中。THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%P/S、10 mM HEPES、1%丙酮酸钠和0.05 mM巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。所有细胞在37摄氏度、5%的二氧化碳下培养。

 

流式细胞术;根据方案进行体外摄取实验。简言之，将HepG2、SK-Hep1和THP1细胞以1×105细胞/cm2的密度接种在12孔板中。为了诱导THP1单核细胞向巨噬细胞分化，在实际摄取实验前72小时，在种子THP-1细胞中加入最终浓度为100 nM的PMA。在摄取实验中，细胞（80%汇合）用37°C DPBs洗涤，并在最终脂质浓度为50、100和200 mM的细胞培养基中培养，相应体积的DPBs为阴性对照。通过去除含脂质体或DPBs的细胞培养基并用1 ml的DPBs洗涤细胞，在培养后3或24小时终止摄取实验。用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下分离细胞，分离时间为8分钟（hepG2，SKHep1）或10分钟（THP1）。加入1 ml冰冷细胞培养基，停止胰蛋白酶反应，200×g和4度下离心5 min收集细胞。用1 ml冷DPB洗涤细胞颗粒，离心并悬浮于500μl FACS缓冲液中（DPB，0.05%NaN3，1%FCS，2.5 mMEDTA）。在561 nm处激发DII荧光，并使用586/15带通滤波器检测。使用Flowjo分析软件V9/X分析20000个细胞的信号。分析中排除了细胞加倍。

 

斑马鱼胚胎培养及注射:如前所述，在斑马鱼胚胎（2 dpf）中注射脂质体样品（10 mM）。用微型操作器、气动皮泵pv830和显微镜，通过普通主静脉将校准体积的1nl脂质体样品注入血液循环。采用奥林巴斯FV-1000倒置共聚焦激光扫描显微镜，配以10×和20×物镜，对注射成功的斑马鱼胚胎进行3小时和24小时的注射后成像。

 

巨噬细胞共定位分析:为了分析脂质体的巨噬细胞清除率，用奥林巴斯FV-1000倒置共聚焦激光扫描显微镜（20×）对转基因斑马鱼胚胎进行了成像。

 

结果：脂质体的制备及理化性质：由于脂质体聚乙二醇化和粒径对脂质体与细胞的相互作用有很大影响，因此选择了一种基于微流体的制备方法来获得与聚乙二醇修饰无关的大小相当的脂质体。为了准确研究FRR与各脂质体组成之间的相互作用，进行了全因子DOE分析。在恒定的FRR下，PEG分子量增加导致脂质体变小。FRR对所有PEG分子量的脂质体大小均有显著影响。PEG浓度（mol%）对脂质体大小的影响随PEG类型而异。基于这些发现，通过对每种配方的FRR进行特殊调整，制备了不同类型的聚乙二醇化脂质体，它们具有一定的尺寸和狭窄的单分散粒径分布。将荧光和放射性标记脂质体样品注入斑马鱼或大鼠体内，分析其在4°C下储存时的稳定性。放射性标记脂质体的脂质体大小和PDI无明显变化。一种荧光标记的制剂在储存一年后显示最终PDI超过0.250。

 

利用一种成熟的体外筛选方法，研究了制备的脂质体与三种代表肝细胞清除率的人细胞系的细胞相互作用。HepG2细胞被用来模拟肝细胞，skhep1细胞来源于肝窦上皮细胞，thp1细胞代表巨噬细胞。所有细胞系均用DII标记脂质体孵育3和24小时，并通过流式细胞术分析，以确定DII阳性（DII+）细胞（表面结合和/或内化）和平均荧光强度（MFI）的分数。可以确定脂质体与具有吞噬或增强内吞潜能的细胞的相互作用程度。培养3小时后，吞噬巨噬细胞（thp1）与肝细胞（hepg2）和肝窦上皮细胞（skhep1）的脂质体细胞相互作用显著增强。值得注意的是，脂质体的细胞相互作用随着时间的推移而增强。在两个时间点（即培养的3 h和24 h），PEG分子量和PEG密度增加导致脂质体清除率降低。3 mol%聚乙二醇修饰的脂质体与6.5 mol%或10 mol%聚乙二醇修饰的脂质体相比，具有更高的清除率。PEG5000比更小的PEG分子量更有效地降低脂质体清除率。

 

聚乙二醇化对斑马鱼模型脂质体清除率的影响：为了评估斑马鱼模型中脂质体的一般清除机制，首先将两种不同的非聚乙二醇化脂质体制剂（dspc:胆固醇，60:40mol%和popc:胆固醇，55:45mol%）注射到表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼血管中。如前所述，由高温脂质dspc组成的脂质体主要通过清除剂受体介导的机制清除。然而，这种强染色模式不允许平行评估巨噬细胞中脂质体的积聚，因为这两个信号是重叠的。为了克服这个问题，可以使用低转变温度脂质（即popc），如基于临床批准的心肌的脂质体配方。基于心肌的配方没有通过清除剂受体清除，但导致了明显的局部血管积聚。进一步的研究表明，巨噬细胞，而不是中性粒细胞，是造成这种清除的原因。另一种降低清除剂受体清除率的方法是用聚乙二醇修饰脂质体。由于聚乙二醇化可以改变其分子量和密度，这为筛选提供了有趣的视角，因此进行了进一步的研究。为此，用微型注射器将聚乙二醇脂质体注入2日龄斑马鱼的血液循环中。每种脂质体制剂注射后24小时（hpi）活体斑马鱼的典型共焦图像。尾静脉和尾造血组织中DII标记的聚乙二醇化脂质体的荧光信号受脂质体表面聚乙二醇分子量和聚乙二醇密度变化的影响较大。为了便于数据评估，对斑马鱼胚胎进行了24 hpi分析，因为随着时间的推移，脂质体积累（代表巨噬细胞清除）的数量增加。与上述体外数据一致，PEG密度较低、PEG分子量较低的脂质体，其尾静脉后壁脂质体堆积量增加。脂质体累积的半定量视觉评分表明，与pg350相比，pg5000减少了两倍的全身清除率。

 

聚乙二醇化对转基因斑马鱼巨噬细胞清除率的影响：在最初的斑马鱼筛选中，聚乙二醇化程度较低的脂质体在体外表现出广泛吸收THP1，并且在巨噬细胞中很可能表现出高度聚集。为了验证这一假设，将含有每个PEG分子量6.5mol%的荧光（即DII标记）脂质体注入转基因斑马鱼体内，在其巨噬细胞中表达绿色荧光kaede蛋白。用共聚焦激光扫描显微镜定性和定量评价巨噬细胞清除脂质体的能力，然后进行共定位分析。随着PEG分子量的降低，我们观察到脂质体与巨噬细胞的共定位作用增强，导致黄色信号，即绿色荧光巨噬细胞清除红色荧光脂质体。除定性分析外，通过计算kaede（即巨噬细胞）和dii的重叠共定位系数来定量巨噬细胞摄取。脂质体的巨噬细胞清除率随PEG分子量的增加而降低，在3-hpi和24-hpi时，导致低和高PEG分子量配方之间的差异具有统计学意义。

 

脂质体大小对斑马鱼巨噬细胞清除率的影响:通过在斑马鱼模型中成功地证明了聚乙二醇化效应，研究了脂质体大小的附加影响。根据体外实验和斑马鱼实验数据，聚乙二醇5000修饰的脂质体无论聚乙二醇浓度如何，巨噬细胞清除率都很低。在进一步的研究中，使用了更小且临床上使用的PEG2000，并与PEG350进行了比较。因此，制备含有6.5 mol% PEG2000或6.5 mol%  PEG350的脂质体，并将其注入斑马鱼体内。24小时后，共聚焦激光扫描显微镜观察巨噬细胞对脂质体的全身清除率。与PEG350相比，PEG2000改性脂质体对所有脂质体的屏蔽作用都更大。有趣的是，与较小的脂质体相比，尺寸大于90 nm的PEG350修饰脂质体的巨噬细胞清除率明显更高。与之形成鲜明对比的是，使用PEG2000对脂质体进行表面修饰，成功地降低了所有脂质体的巨噬细胞摄取，而与大小无关。斑马鱼筛选显示脂质体大小与脂质体屏蔽的聚乙二醇分子量之间存在明显的相关性。

 

脂质体大小和聚乙二醇化对大鼠脾脏清除率的影响:我们分析了24个hpi的器官生物分布，重点是脾脏清除，脾脏含有大量的组织驻留巨噬细胞。正如我们在斑马鱼实验中观察到的，脂质体大小与巨噬细胞清除率（脾脏内高蓄积）密切相关。平均大小为120 nm的脂质体在脾脏中的积聚增加。

 

结论：本研究以斑马鱼为参照物，成功地应用并验证了斑马鱼对纳米颗粒巨噬细胞清除率的影响。斑马鱼可以作为一种工具来模拟体内的复杂情况，其优点是能够以一种时间和成本效益的方式筛选大量纳米颗粒样品，并在纳米药物开发过程的早期阶段作为一种体内预测工具。