摘要：背景：尽管保留了脊椎动物的发育过程和中枢神经系统的组织，但只有包括斑马鱼在内的一些脊椎动物才能有效地再生神经损伤，包括脊髓损伤后的再生。哺乳动物脊髓的再生和神经发生非常有限，导致永久性终身功能损害。因此，迫切需要确定损伤后有效促进脊椎动物神经发生的细胞和分子机制。斑马鱼神经发生的一个关键途径是成纤维细胞生长因子信号传导。

 

方法：在本研究中，我们研究了不同成纤维细胞生长因子成员及其受体在促进脊髓损伤后不同时间点神经发育和再生的不同方面的作用。在成人脊髓损伤后和幼鱼发育过程中，将Fgf信号的丢失和/或获得与免疫组织化学、原位杂交和转基因相结合，在活体斑马鱼和体外哺乳动物PC12细胞培养模型中标记运动神经元群。

 

结果：Fgf3驱动表达Islet1的运动神经元亚型的神经发生，并介导表达CMET的运动神经元亚型的轴突生成。我们还证明，Fgf成员的作用不一定是简单的概括发展。在发育过程中Fgf2，Fgf3和Fgf8介导Islet1表达神经元的神经发生表达Islet1和cMet的运动神经元的神经元萌发。在哺乳动物PC12细胞中，所有三种Fgf都增加了细胞增殖，然而，只有Fgf2和Fgf8在一定程度上促进了轴突的生长，而Fgf3没有促进轴突的生长。

 

结论：这项研究表明，在神经发育和成人再生过程中，包括促进不同脊髓神经元群的神经增殖和轴突生长的过程中，Fgf成员的作用是不同的，提示包括Fgf类型、机体年龄、表达时间、对不同神经元群体的需求可以量身定做，以最好地驱动所有所需的再生过程。

 

 

背景：脊髓损伤（SCI）在人体内引发的再生非常有限，导致不可逆的损伤，从而导致永久性瘫痪。相比之下，非哺乳动物脊椎动物，如鱼类，能有效地再生脊髓中受损的神经细胞，即使成年后也能完全恢复功能。神经发生和神经元存活，特别是运动神经元，对于提高哺乳动物的功能恢复至关重要。然而，影响脊髓损伤后脊椎动物神经发生的机制尚不清楚，因此缺乏治疗策略。在潜在的促再生神经因子中，成纤维细胞生长因子（Fgf）信号通路已被证实影响血管生成、有丝分裂、细胞分化、细胞迁移和组织损伤修复，包括大脑的发育和成熟。在啮齿动物和人类中，22个Fgf配体可细分为细胞内（11-14）、激素样（15/21/23）和典型的Fgf亚家族。四个受体的组织特异性选择性剪接Fgfr1–4 mRNAs导致额外的配体-受体组合，它们独特的时空表达模式允许Fgf信号在不同的生物学过程中发挥作用。跨物种比较表明，Fgf具有高度的保守性。在中枢神经系统中，包括2、3和8在内的几个Fgf在成年斑马鱼大脑中，包括在祖细胞区中有特异性表达。在哺乳动物中，Fgf2表达于神经原区，如大脑皮层、丘、丘脑和嗅球。在成年哺乳动物海马细胞培养中，Fgf2刺激祖细胞增殖，注入后可增加小鼠或大鼠齿状回和室管膜下区的神经发生。在成年小鼠中，在正常或损伤条件下，Fgf2基因敲除可减少海马和心下区神经祖细胞分裂的数量，并减少嗅球和运动皮层内新生神经元的数量。单次局部注射Fgf2可通过保护表达胆碱乙酰转移酶的腹角运动神经元免受细胞死亡而预防脊髓损伤引起的呼吸异常，并改善恢复。Fgf4在成年斑马鱼中枢神经系统中广泛表达，能促进神经祖细胞的增殖和分化。在成年斑马鱼中，Fgf3和Fgf8在神经祖细胞中高度表达，如小叶下和嗅球之间的心室区、中脑和细小细胞视前核（仅Fgf3）。Fgf3和Fgf8a在端脑的腹神经胶质区表达。这个区域的Fgfrs在更多的细胞中表达，从而导致更广泛的下游靶分子表达。其他研究表明，aFgf或碱性Fgf2可促进人和动物脊髓或背根神经节轴突切除神经元在脊髓损伤后的再生，进而改善功能性运动行为。在皮质神经胶质细胞培养中，AFgf通过Akt（蛋白激酶B）和Erk（细胞外信号调节激酶）激活增强神经元连接，有效地防止缺氧葡萄糖诱导的神经元损伤。在活体脑缺血大鼠模型中，纤维蛋白胶内稳定的AFgf可减少缺血脑损伤和小胶质细胞浸润。因此，Fgf信号在成人中枢神经系统中显示出高度保守的作用，包括损伤后。阐明不同Fgf在中枢神经系统再生过程中的作用，使我们能够靶向合适的Fgf配体，并纠正时间窗，以改善运动神经元的再生。标记不同运动神经元亚群的两个重要标记是C-met和islet1。C-met编码肝细胞生长因子膜受体，在静止肌卫星干细胞以及大细胞体初级运动神经元（中初级、头端初级和尾端初级神经元）和侧线神经中表达。Islet1是所有脑运动神经元、部分脑感觉神经元和脊髓后体运动神经元中表达的转录因子。?在发育过程中，较小的二级运动神经元中的islet1表达与lhx3结合，促进运动神经元在V2神经元分化过程中的作用。 这两个标记标记了斑马鱼脊髓内不同的运动神经元群。之前，我们已经证明了Fgfs在胶质发生和胶质桥形成中的作用，随后轴突通过损伤区域再生。在放射状胶质细胞和运动神经元周围的损伤部位，发现Fgf3和Fgf8表达上调，因此我们假设这些Fgf可能有助于损伤部位观察到的神经发生。通过比较不同的Fgf在Islet1和C-met运动神经元以及跨物种再生和发育过程中的作用，我们开始剖析在新的治疗中可选择性靶向的Fgf的不同作用。

 

斑马鱼品种：使用不同品种的成鱼（3-6个月大）和两种性别的胚胎。这些包括将不同细胞群可视化的转基因细胞系：Tg（gfap:EGFPmi2001）标记由胶质纤维酸性蛋白启动子驱动的中枢神经系统中的径向胶质细胞，Tg（lsl1:EGFPrw0）标记脊髓中的次级运动神经元（除了颅运动和一些感觉神经元），Tg（vsx1:GFP）标记由视觉同源盒1 promo驱动的脊髓中的神经元。Tg（met:gal4；UAS:EGFP）ed6Tg和Tg（met:mcherry 2a KalTA4）pc24Tg使用C-met启动子驱动初级运动神经元的报告表达，这代表了一个与表达lslet1的神经元不同的群体。使用两个品系来操纵Fgf信号：tg（hsp70l:dn-Fgfr1-EGFPpd）1，其中热休克诱导显性负向Fgfr1（Fgf信号抑制）的表达，以及spry4?/?fh117突变体，它们代表了Fgf信号功能的增益，因为关键的下游负向调节缺失。

 

脊髓损伤：在完全麻醉的鱼身上进行脊髓损伤和注射（腹膜内或病变部位）。使用0.033%甲基磺酸三卡因（MS-222）对斑马鱼进行充分麻醉，直到鳃盖停止呼吸运动（3–5分钟）。背鳍和盖骨之间的中间部分，相当于脊髓的第八个椎骨（距盖骨尾端约5 mm）。通过肌肉层进行纵向切口，将肌肉组织放在一边露出脊柱。然后用微型剪刀将脊柱完全切除。伤口用一滴3 M的Vetbond密封。从含麻醉剂的鱼缸中取出鱼，将鱼放入正常水中，鱼很快从麻醉状态中恢复。

 

抑制Fgf信号的热休克处理：热休克对TG（hsp70L:dn-Fgfr1-EGFP）转基因或野生型对照动物有明显的负向作用。在脊髓损伤前4h，动物暴露于温度从26°C升高到38°C的环境中，并在38°C下保持60°min，鱼每天暴露在这种热休克状态下一次，并在指定的时间点收集脊髓。

 

溴脱氧尿苷注射:在完全麻醉的鱼中，在损伤后0、2和4天，或在年龄匹配的对照非损伤鱼中,腹腔注射50μl BrdU（2.5 mg/ml溶于PBS）.

 

Fgf3注射剂：从脊髓损伤后5或10天开始，每天完全麻醉TG（isl1:EGFP）鱼腹腔注射重组人Fgf3（0.14μg/注射/fish），人Fgf3中心区与斑马鱼Fgf3具有72%的氨基酸同源性。

 

体内吗啡寡聚核苷酸注射：脊髓横断后立即向病变部位注射1μl 0.5 mm（5μg/注射/fish）Fgf3吗啡寡聚核苷酸（5’CATTG TGGCATGGCGGGATGTCGGC3’）'或活体标准对照吗啡寡聚核苷酸（5’CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA3’）。在斑马鱼幼虫体内注射吗啡寡聚核苷酸，在Fgf3突变体中观察到的小囊泡。

 

组织制备：在脊髓损伤后的不同时间点（3、6、10、14天），用0.2%的MS-222缓冲液进行深度麻醉，对鱼类进行安乐死。在室温下，暴露大脑和脊髓。并在4%多聚甲醛（PFA）中固定2小时。随后，在室温下将大脑和脊髓解剖并固定2–3 h，在4%PFA中浸泡2-3 h，然后在4°C下将30%蔗糖PBS溶液中过夜，进行OCT包埋。采用20μm厚的冷冻切片进行免疫组化，30μm厚的冷冻切片进行原位杂交。

 

幼虫的Fgf暴露：对于Fgf暴露，在受精后24小时（hpf）使用TG（met:gal4；uas:EGFP）ed6tg或TG（isl1:gfprw0/met:mcherry 2A kalta4pc24tg）双转基因胚胎。胚胎在1.5μg/ml的Fgf3/8或2稀释于胚胎培养基或单独的胚胎培养基（对照）中培养48小时，在第一个24小时后更换胚胎培养基。

 

脊髓损伤后BrdU阳性细胞定量分析：脊髓节段的lsl1:EGFP标记细胞或brdu/lsl1:EGFP双标记细胞的数量在距病变两侧病变部位最近的200平方微米网格内计数。c-met神经节定量分析：在脊髓损伤后10天，在离病变部位远端和近端350μm处量化TG（met:gal4；uas:EGFP）鱼中c-met标记的轴突数量。

 

结果：脊髓损伤后的Fgf信号介导损伤部位神经元的神经发生：为了研究脊髓损伤后Fgf如何以及在哪些细胞中影响神经发生，我们检测了损伤后2周损伤部位Fgf通路的主要下游效应器P-MAPK（p44/42）的激活。TG（gfp:EGFP）mir2001斑马鱼系，其中胶质纤维酸性蛋白启动子驱动gfp报告基因的表达，用于标记脊髓中央管周围室管膜放射状胶质细胞，这是脊髓损伤后负责有效神经再生的常驻干细胞群。与未损伤脊髓中P-MAPK的少量表达不同，脊髓损伤后2周，在损伤部位的中央管内可观察到P-MAPK的激活，包括GFAP:EGFP阴性细胞，这可能属于olig2阳性胶质细胞的亚群，尽管其中至少有一部分还具有神经元细胞形态。我们的研究表明，在果蝇、爪蟾和斑马鱼体内，Fgf负责MAPK磷酸化的全部模式。在斑马鱼脑亚群区域发育过程中已被证实为Fgf3和Fgf8。在斑马鱼的sci神经元再生过程中，P-MAPK是由Fgf信号驱动的。脊髓损伤后P-MAPK上调。TG（lsl1:EGFP）斑马鱼系的检查显示，损伤部位的p-mapk增加，与lsl1:gfp阳性神经元共标记。因此，脊髓损伤后新生神经元损伤部位的Fgf信号被激活。为了直接评估Fgf是否不仅在这些新神经元中表达，而且直接影响它们的神经发生，我们在功能丧失和增强实验中比较了损伤部位的神经元数量。作为神经发生的一种测量方法，在脊髓损伤后2周，比较完整的未受伤对照脊髓和脊髓中免疫标记的neun阳性神经元的数量。对于Fgf功能的丧失，热休克处理应用于TG（hsp70:dn-Fgfr1）斑马鱼，导致显性负性Fgfr1受体的普遍诱导和有效阻断Fgf信号传导。Fgf信号的丢失对控制完整脊髓没有显著影响，但明显阻止了在脊髓损伤后2周的野生型条件下观察到的neun标记神经元数量的增加。这表明，Fgf信号确实是必要的，以增加病变部位神经发生。为了获得功能，在spry4-突变斑马鱼系中进行脊髓损伤。SPRY4是Fgf信号的下游靶点，是Fgf通路的有效反馈抑制剂。在功能丧失的spry4?/?突变体中，导致Fgf信号的增加。尽管SPRY4?/?突变体在脊髓损伤后2周未改变神经原标记的神经元数量，但与脊髓损伤后的完整和野生型相比，SPRY4?/?突变体中表达神经原的神经元数量显著增加。综上所述，这些结果表明斑马鱼脊髓损伤后的Fgf信号上调，并通过新产生的神经元中的MAPK途径发挥作用，这对于观察到的再生神经发生是必要的和足够的。

 

Fgf3配体介导 Islet1神经发生:在斑马鱼脊髓损伤后，Fgf8和Fgf3的mRNA水平分别在桡神经胶质细胞和运动神经元细胞中有特异性上调。因此，我们研究了脊髓损伤后腹腔内注射Fgf3和Fgf8是否能介导观察到的再生神经发生。在脊髓损伤后5天和10天，对tg（lsl1:gfp）神经元数量的量化显示，在Fgf3后，神经发生显著增加。与对照组相比，在损伤后，Fgf8没有显示Islet1阳性神经元的显著增加。我们还用tg（vsx1:gfp）斑马鱼系检测了脊髓损伤后Fgf3介导的神经元间发生，没有观察到任何显著的增加。这表明，不同的Fgf配体介导特定神经元群体的再生神经发生。 定量分析Brdu掺入作为DNA合成和细胞增殖的标志物，结果显示，与PBS对照注射相比，新产生的lsl1:gfp/brdu标记的神经元在Fgf3注射的鱼脊髓损伤3天后已经存在。在病变部位没有出现任何lsl1:gfp/brdu双标记细胞。在脊髓损伤后10天，通过体内吗啡寡聚核苷酸直接注射到病变部位抑制Fgf3显著减少了Islet1+细胞的总数。在斑马鱼幼虫体内注射了Fgf3吗啡寡聚体，这与Fgf3突变体中观察到的小囊泡现象相似，尽管结果相对微妙。与抑制Fgf3的效果一致，当使用Fgf3注射上调Fgf3时，观察到相反的结果。脊髓损伤后，Fgf3注射能显著增加lsl1:EGFP的总数，也能显著增加isl1:EGFP细胞的数量和比例，这些细胞对brdu标记呈阳性。与对照组相比，注射Fgf3后，来自病变部位中心100–500μm的lsl1:EGFP标记的小神经元（brdu阳性或阴性）总数显著增加，抑制Fgf3后减少。。此外，Islet1细胞在损伤后第二周继续产生，与对照鱼相似。因此，脊髓损伤后的神经发生是由Fgf3特异性介导的。为了检测Fgf3是否特异性增加Islet1表达的运动神经元亚群的数量，我们还研究了Fgf3是否同样介导脊髓损伤后c-met表达的运动神经元的增殖。损伤部位经Fgf3处理后c-met阳性细胞无明显增加。与对照组动物相比，在距损伤部位中心350μm处注射Fgf3后10天，c-met标记的TG（met:gal4；UAS:EGFP）中脊髓损伤后量化的神经轴突数量显著增加，这表明c-met神经元亚群的轴突发生是由Fgf3介导的。

 

脊髓损伤后神经细胞Fgf受体表达增加：完整脊髓中央管周围的细胞表达FgfR1、2和3。在脊髓损伤后，所有这些Fgf受体上调。为了具体评估哪些细胞群可能在脊髓损伤后上调不同的Fgf受体表达，在GFAP标记的放射状胶质细胞和新的Islet1或c-met表达神经元中评估了FgfR1、2和3的表达。另外一个放射状胶质亚群也可能表达低水平的gfap和高水平的olig2。虽然这些祖细胞通常产生少突胶质细胞，但它们也在脊髓损伤后产生运动神经元。

 

结论：在斑马鱼横断模型中，成年脊髓损伤后的神经发生过程中存在着Fgf信号。。不同的Fgf成员及其受体在中枢神经中的广泛分布强化了一种观念，即Fgf信号在大脑发育中起着关键作用，在损伤后也可能是关键的。不同的配体和受体可能在神经损伤后的不同时期介导神经发生的不同方面。不同的作用可能取决于动物的年龄，因此，继续努力解开哪些配体和哪些受体将在特定时间点影响不同的细胞类型或过程，将有助于设计量身定制的治疗干预的关键信息。在我们的Fgf增益和功能丧失实验中，P-MAPK和神经元标志物Islet1的共同表达，以及损伤后出生的神经元数量。进一步指出，在驱动神经发生过程中，例如神经损伤，有一个显著的激活。