摘要：重组组织纤溶酶原激活剂（RT-PA）是急性脑梗死（ACI）治疗中血管重建的一线药物。本研究采用改良的大鼠脑中动脉栓塞模型治疗缺血性卒中，并于模型建立后第1天、第3天和第7天处死大鼠。溶栓组在每个时间点的梗死体积增加明显低于常规组。溶栓组的微血管密度（MVD）在每个时间点都明显高于常规组，尤其是在第7天。缺血区神经元一氧化氮合酶（nos）和caspase-3表达增加。溶栓组一氧化氮含量、丙二醛含量、梗死侧皮质诱导型一氧化氮合酶活性明显低于常规组。此外，溶栓组超氧化物歧化酶活性的降低明显低于常规组。综上所述，在扩大的治疗窗（6小时）内进行溶栓RT-PA治疗，可能通过增加缺血区MVD、降低凋亡分子表达和减轻氧化应激反应，从而显著降低ACI后梗死体积。

 

简介：中风是影响人类健康的最常见疾病之一，是中国第二大死亡原因和第一大致残原因。1995年首次报道重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA）对急性脑梗死（ACI）患者有效。最近的一项研究表明，rt-PA仍然是ACI治疗中用于血运重建的一线药物。由于4.5小时溶栓时间窗口的限制，大多数患者没有机会接受这种治疗。因此，在急性缺血性卒中的治疗中需要采取有效的措施。近年来，据报道，ACI患者的溶栓治疗可在ACI后6小时进行。最近的研究表明，ACI后3-9小时的溶栓治疗可显著改善磁共振成像或计算机断层扫描结果以及临床结果。然而，在拓宽的治疗窗口内溶栓治疗的机制并不明显。新生血管是ACI后缺血神经存活的关键因素，对学习记忆能力的恢复和预后的改善至关重要。缺血和再灌注可导致自由基和脂质过氧化显著增加，从而加重脑损伤。一氧化氮（NO）是一种活性气体自由基，过量释放会导致神经元损伤。丙二醛（MDA），脂质过氧化的降解产物，也会对大脑造成直接损害。超氧化物歧化酶（SOD）是脑组织中一种重要的抗氧化酶，通过清除细胞内过多的自由基在脑保护中起着重要作用。因此，这些分子可能是rt-PA对ACI影响的关键调节器。在本研究中，我们采用改进的大鼠脑中动脉栓塞（MCAO）模型，研究了MCAO后6小时用rt-pa溶栓治疗对ACI后缺血区梗死体积、微血管密度（MVD）、caspase-3、一氧化氮、一氧化氮合酶（NOS）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的影响，目的在于揭示心肌梗塞后6小时大鼠脑中动脉栓塞（MCAO）的机制。在拓宽的治疗窗口内对溶栓治疗的机理进行研究，为ACI的临床治疗提供可靠的理论依据。

 

材料和方法：动物：成年雄性大鼠（320-350克），162只，2月龄。所有大鼠均在8:16光照周期，温度（22±2°C）和湿度（58%-68%）的房间中饲养。将其平均随机分为三组（每组54只大鼠）：假手术组、常规组（即常规治疗梗死组）和溶栓组（即ACI后6小时用RT-PA治疗梗死组）。根据模型建立后的天数（第一天、第三天或第七天），每组进一步随机平均分为三组（每组18只大鼠）。

 

大脑中动脉闭塞模型：建立了一个用自体血凝块栓塞的大鼠MCAO模型：（a）制备血栓：将从尾静脉提取的0.6 ml静脉血和0.15 ml凝血酶（200 U/ml）混合，快速放入PE50管中，静置4小时。血栓被切开成小栓子（1毫米），放入PE50管内备用。（b）栓塞MCAO模型的建立：大鼠腹腔注射6%水合氯醛（35 mg/100 g）进行麻醉。在颈部做一个2 cm长的中线切口，然后解剖右颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）、枕动脉（OA）、甲状腺上动脉（STA）和翼腭动脉（PPA）。结扎OA、STA、PPA和ECA远端，暂时剪断CCA和ICA。将含有血块的PE-50管插入到ECA近端，然后打开微血管夹，以便进行血块输注（10-12个栓塞）。取下CCA夹片，缝合切口。（c）干预：常规组在MCAO后24小时腹腔注射胞苷（500mg/kg，每天一次）。溶栓组在上述药物的基础上，在MCAO 6小时后静脉注射rt-PA（10 mg/kg）；假手术组也进行了同样的程序，除了不输注凝块和静脉注射溶栓剂。如前所述，在建立模型后进行0-4的评分量表，以获得神经功能缺损量表。0-无明显的神经功能缺损；1-轻度神经功能障碍（即用尾巴抬起大鼠时，对侧前肢不能完全伸展）；2-中度局灶性神经功能障碍（即走路时向右旋转）；3-重度局灶性神经功能障碍(行走时向右倾倒)。4-无法行走或昏迷。分数为1-3的大鼠被认为是梗塞。

 

2,3,5-三苯基四唑氯化物染色：在模型建立后的第一天、第三天和第七天，从上述三组中随机抽取6只大鼠。大鼠被深度麻醉致死。大脑被迅速切除，冠状切片为2毫米，并用2%的溶于0.9%盐水的2,3,5-三苯基四唑氯化物在37℃黑暗环境下染色30分钟。将切片固定在10%中性福尔马林中过夜，然后用数码相机拍摄照片。梗死面积标准化为水肿。每个大脑的梗死体积计算为I%=（同侧对侧-正常容量）/对侧大脑体积。

 

免疫组化：在模型建立后的第一天、第三天和第七天，从上述三组中随机抽取6只大鼠。动物被处死，灌注0.9%生理盐水，然后灌注4%多聚甲醛。大脑被迅速移除，用4%多聚甲醛固定24小时，并嵌入石蜡中。用免疫组化法进行连续冷冻切片（3μm）并进行检查。使用的主要抗体是兔抗鼠CD34抗体（1:100）、抗nNOS抗体（1:100）和抗caspase-3抗体（1:50）。采用磷酸盐缓冲盐水作阴性对照。用二氨基联苯胺观察反应。在显微镜下（400 x）观察梗死组缺血区的MVD、nNOS阳性细胞和caspase-3阳性细胞。每个切片随机选择5个区域进行微血管或阳性细胞数计数。平均值作为该切片的mvd或nnos或caspase-3的表达。每组所有切片的微血管或阳性细胞数计数的平均值作为MVD，或该组nNOS或caspase-3的表达。

 

一氧化氮、丙二醛含量及肌苷、超氧化物歧化酶活性的测定：在模型建立后的第一天、第三天和第七天，从上述三组中随机抽取6只大鼠。动物被处死，大脑被迅速摘。将梗塞侧皮质迅速冷冻在液氮中，然后储存在?80°C。将皮层组织样品在冷盐水中均匀化，得到10%的匀浆。然后在1248 g下离心，收集上清液并在-80°C下储存。根据制造商的说明，分别使用一氧化氮分析试剂盒、丙二醛分析试剂盒（TBA法）、NOS型分析试剂盒（测色法）和SOD分析试剂盒（WST-1法）测量一氧化氮和丙二醛含量以及iNOS和SOD活性。

 

结果：溶栓降低MCAO后梗死体积：假手术组未见明显梗死区，梗死组可见明显梗死区（白色）。在每个时间点，常规组的梗死体积均明显高于假手术组。与常规组相比，溶栓能有效地降低每个时间点的梗死体积。

 

溶栓增加了MCAO后的MVD：假手术组的MVD在任何时间点均无变化。梗死组，尤其是溶栓组的MVD表达在每个时间点都显著升高。此外，溶栓组的MVD表达在所有时间点均明显高于常规组（P<0.05），尤其是在第7天。

 

溶栓降低MCAO后nNOS和caspase-3的表达：nNOS阳性细胞和caspase-3阳性细胞用棕色或棕褐色染色。假手术组阳性细胞较少。MACO后一天，常规组缺血区nNOS和caspase-3的表达较假手术组增强。此外，溶栓组与常规组相比，其表达降低。

 

溶栓降低了MCAO后的自由基活性和SOD活性：与假手术组相比，梗死侧皮质一氧化氮、丙二醛含量和iNOS活性在所有时间点均显著增加（P<0.05），但溶栓治疗组与常规治疗组相比显著降低。相反，与假手术组相比，梗死侧皮质SOD活性在所有时间点均降低（p<0.05），溶栓组SOD活性在溶栓组显著高于常规组。

 

结论：在拓宽的治疗窗（6小时）内用rt-PA溶栓治疗可显著降低ACI后梗死体积，可能通过增加MVD、降低凋亡分子表达、降低自由基活性和增强SOD活性来减轻氧化应激反应。